中藥髓復(fù)康促進(jìn)恒河猴脊髓損傷修復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、脊髓損傷(Spinal cord injury,SCI)是一種常見(jiàn)的、致殘率很高的疾病,給患者、家庭和社會(huì)造成很大的負(fù)擔(dān)。而原發(fā)性脊髓損傷后的繼發(fā)性損害所造成的更大范圍的神經(jīng)組織損傷是導(dǎo)致?lián)p傷后功能難以恢復(fù)的關(guān)鍵因素之一。因此,在治療SCI時(shí)應(yīng)該考慮到以下兩點(diǎn):第一,應(yīng)積極的預(yù)防和最大限度地設(shè)法緩解繼發(fā)性脊髓損傷,保護(hù)受損傷的神經(jīng)元；第二,應(yīng)盡早采取能夠促進(jìn)損傷神經(jīng)軸突修復(fù)和再生的治療措施。目前,SCI的治療仍以手術(shù)為主。通過(guò)手術(shù)減壓、

2、固定、緩解受傷脊髓節(jié)段所受到的壓迫,但結(jié)果并不盡人意。因此,在手術(shù)治療基礎(chǔ)上研發(fā)確有療效的藥物,以減少繼發(fā)性損害是目前研究的熱點(diǎn),具有廣闊的前景。
　　 中藥方藥“髓復(fù)康”(Suifukang,SFK)是由黃芪、川芎、赤芍、紅花、葛根和三七等8位中藥組成,主要功效是益氣生陽(yáng),活血通絡(luò),補(bǔ)腎生髓。自1984～2004年,我導(dǎo)師從行為學(xué)、病理組織學(xué)、電生理學(xué)、HRP神經(jīng)束追蹤、神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)體外培養(yǎng)、電鏡亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和基因蛋白表達(dá)等

3、多方面,對(duì)SFK治療大鼠實(shí)驗(yàn)性急性脊髓損傷(Acute spinal cord injury,ASCI)進(jìn)行了較為深入的研究和探索。結(jié)果表明,該藥不僅具有肯定的中樞神經(jīng)元保護(hù)作用,而且也具有促進(jìn)脊髓損傷組織修復(fù)與再生的作用。2005年國(guó)家自然科學(xué)基金立項(xiàng)資助本課題的研究,主要目的是系統(tǒng)而嚴(yán)格地檢驗(yàn)SFK治療恒河猴SCI的療效和促進(jìn)損傷脊髓修復(fù)和再生的作用,并進(jìn)一步探討其作用機(jī)理。
　　 1目的:
　　 通過(guò)觀察中藥髓復(fù)康

4、對(duì)脊髓半橫斷損傷后恒河猴行為學(xué)、血液中自由基、脊髓病理組織學(xué)、與脊髓修復(fù)和再生的相關(guān)蛋白Nogo—A、GAP-43及Tau表達(dá)變化的情況,檢驗(yàn)髓復(fù)康對(duì)損傷脊髓修復(fù)再生的作用。
　　 2材料和方法:
　　 14只健康成年雄性恒河猴,其中10只在無(wú)菌手術(shù)下造成第12胸髓(T12)右側(cè)半橫斷損傷模型。術(shù)后隨機(jī)分為兩組,即SFK組(S組)5只,模型對(duì)照組(M組)5只。S組術(shù)后逐日灌喂SFK水煎劑,生藥劑量為每次8.55g/kg(

5、20ml),每日一次；M組灌服等量的生理鹽水,另外四只為正常組(N)不做任何處置。在術(shù)后1d、7d、14d、21d和30d,分別對(duì)各組恒河猴的運(yùn)動(dòng)功能進(jìn)行評(píng)分。術(shù)后30天,動(dòng)物經(jīng)麻醉后,從左心室取血2ml備用,檢測(cè)SOD、MDA的變化。然后用4％多聚甲醛(0.01M PBS液配制,Ph7.2—7.4)經(jīng)心臟主動(dòng)脈插管灌注處死動(dòng)物。取損傷部位的脊髓組織,進(jìn)行HE、尼氏及髓鞘染色,觀察病理組織學(xué)變化；采用免疫組化檢測(cè)Nogo—A、GAP-4

6、3及Tau蛋白表達(dá)的改變；為進(jìn)一步研究,采用原位雜交方法檢測(cè)Nogo—AmRNA、GAP-43mRNA表達(dá)的變化。通過(guò)光鏡觀察脊髓病變部位病理組織結(jié)構(gòu)的變化；利用3Y圖像分析儀分析Nissle染色切片內(nèi)正常神經(jīng)元的數(shù)量及Nogo—A和GAP-43陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)；以及Nogo—A和GAP-43、Tau蛋白陽(yáng)性表達(dá)物及其mRNA的平均光密度(optical density mean,OD)
　　 3結(jié)果和結(jié)論
　　 3.1髓復(fù)康

7、對(duì)恒河猴脊髓損傷后運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的觀察
　　 結(jié)果:術(shù)后1d,各損傷組運(yùn)動(dòng)功能明顯降低,肌力為0。術(shù)后7d,兩損傷組分值略有增加,S組得分高于M組,但兩組比較無(wú)明顯差異；術(shù)后14d、21d,兩損傷組分值均有所增加,但S組增加更為明顯,與M組比較差異顯著(P<0.05),但仍明顯低于N組(P<0.05)；術(shù)后30d,M組分值最低,與S組比較差異顯著(P<0.05),S組分值繼續(xù)增加,但仍低于N組,組間差異顯著(P<0.05)。

8、>　　 結(jié)論:組成SFK的益氣活血藥可以加速脊髓損傷恒河猴運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù),且療效顯著。
　　 3.2髓復(fù)康對(duì)恒河猴脊髓損傷后血液中自由基變化的影響
　　 結(jié)果:損傷后,M組SOD活性下降,而S組SOD活性明顯高于M組(P<0.05),與N組接近；各損傷血液中MDA含量均上升,但M組升高更明顯,與S組比較(P<0.05)。
　　 結(jié)論:SFK能有效清除SCI后血液中過(guò)多的自由基,并能提高機(jī)體搞氧化能力,在一定程度

9、上保護(hù)了脊髓損傷組織,減輕了SSCI。為修復(fù)和再生提供了有利的外部環(huán)境。
　　 3.3髓復(fù)康對(duì)恒河猴脊髓損傷后病理組織學(xué)變化的影響
　　 結(jié)果:(1)HE染色結(jié)果顯示:S組脊髓損傷區(qū)面積小于M組,S組的脊髓損傷灶多局限在脊髓右側(cè),而M組的多累及對(duì)側(cè)。
　　 (2)尼氏染色結(jié)果顯示:S組正常神經(jīng)元的數(shù)量多于明顯多于B組(P<0.05)；但仍少于正常組,且差異顯著(P<0.05)。
　　 (3)神經(jīng)髓鞘染色結(jié)

10、果顯示:S組脊髓損傷灶內(nèi)有一些神經(jīng)纖維,在損傷灶鄰區(qū)內(nèi)神經(jīng)纖維數(shù)量也明顯多于M組。
　　 結(jié)論:由益氣活血藥組成的SFK能減輕ASCI后的SSCI,使損傷灶面積縮小,且SFK具有神經(jīng)元保護(hù)作用,能減輕損傷導(dǎo)致的脫髓鞘反應(yīng)。
　　 3.4髓復(fù)康對(duì)恒河猴脊髓損傷后Nogo—A表達(dá)的影響
　　 結(jié)果:(1)免疫組化結(jié)果顯示:正常恒河猴脊髓組織中有微量Nogo—A蛋白表達(dá),損傷后Nogo—A陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增多,與正常組比

11、較差異顯著(P<0.05),且Nogo—A蛋白陽(yáng)性表達(dá)物平均光密度也明顯上調(diào),與N組比較差異顯著(P<0.05)；髓復(fù)康治療后,Nogo—A蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少,與M組比較有明顯差異(P<0.05),其陽(yáng)性表達(dá)物平均光密度也明顯下調(diào),S組與M組相比有明顯差異(P<0.05)。
　　 (2)原位雜交結(jié)果顯示:脊髓損傷后,Nogo—AmRNA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增多,Nogo—AmRNA陽(yáng)性表達(dá)物的平均光密度明顯上調(diào),M組與N組相比差異

12、顯著(P<0.05)；而S組Nogo—AmRNA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯少于M組(P<0.05),Nogo—AmRNA陽(yáng)性表達(dá)物平均光密度下調(diào)明顯,與M組比較差異顯著(P<0.05)。
　　 結(jié)論:SFK對(duì)Nogo—A的表達(dá)有明顯的抑制作用,從而為神經(jīng)纖維的再生提供了有利內(nèi)部微環(huán)境
　　 3.5髓復(fù)康對(duì)恒河猴脊髓損傷后GAP-43表達(dá)的影響
　　 結(jié)果:(1)免疫組化結(jié)果顯示:脊髓損傷后,GAP-43陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)可明顯增多,

13、M組與N組比較有顯著差異(P<0.05),同時(shí)M組GAP-43蛋白陽(yáng)性表達(dá)產(chǎn)物平均光密度也上調(diào)明顯,與N組比較差異顯著(P<0.05)；S組GAP-43蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量及其陽(yáng)性表達(dá)物的光密度增加更為明顯,與M組比較差異顯著(P<0.05)。
　　 (2)原位雜交結(jié)果顯示:正常恒河猴脊髓組織中有微量GAP-43mRNA表達(dá),脊髓損傷后誘導(dǎo)GAP-43mRNA表達(dá)升高,M組與N組比較差異顯著(P<0.05)；髓復(fù)康干預(yù)后,使脊髓中G

14、AP-43mRNA表達(dá)上調(diào)更為明顯與M組比較差異顯著(P<0.05)。
　　 結(jié)論:SFK具有促進(jìn)脊髓內(nèi)損傷神經(jīng)的修復(fù)和再生的作用。SFK可以促進(jìn)損傷相應(yīng)脊髓節(jié)段GAP-43的表達(dá),促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)。
　　 3.6髓復(fù)康對(duì)恒河猴脊髓半橫斷損傷后Tau蛋白表達(dá)的影響
　　 免疫組化結(jié)果顯示:正常恒河猴脊髓組織中有Tau蛋白表達(dá),損傷后M組Tau表達(dá)下降,與正常組相比,差異顯著(P<0.05)；髓復(fù)康治療后,Tau