HC-ACBM聯(lián)合負壓吸引修復恒河猴骨缺損的實驗研究.pdf

1、研究背景:
　　 臨床上，面對因各種原因所致骨缺損、尤其是大塊骨缺損，一直以來沒有很理想的修復材料可供選擇，而當前因車禍、腫瘤所導致的骨缺損發(fā)生率卻呈上升趨勢。骨缺損修復目前常用的支架材料主要有自體骨、同種異體骨、骨水泥、陶瓷及一些相關的衍生材料等，這些支架材料均存在不同程度的缺點。組織工程骨的興起為骨缺損修復支架材料指明了新的發(fā)展方向，組織工程自1987年正式提出和確定后，在種子細胞、支架材料和組織構建技術等方面取得了明顯進展

2、，但是仍有一些問題尚待解決和完善，組織工程骨的血管化就是其中之一。
　　 骨缺損植入修復材料后血管新生需要一個較長的過程，早期的氧和營養(yǎng)僅能靠受體的組織液滲透供應，并且植入的材料由于機體的凝血反應會被凝血塊包裹，從而使?jié)B透更加困難，因此其大小嚴重受到局限，這顯然遠遠不能滿足臨床應用的要求。促進組織工程骨血管化的方法常見的有：用膠原、促血管生成的生長因子等修飾支架材料；或?qū)⒊晒欠N子細胞與血管內(nèi)皮細胞、成血管前體細胞共培養(yǎng)等，但是效

3、果欠佳。考慮到移植的組織工程骨主要靠外周血管芽生的方式血管化，一些研究小組利用外周血管芽生的策略，提出了組織工程骨支架材料的預血管化技術：將材料和細胞復合物包埋于皮下、大網(wǎng)膜、筋膜或肌袋中待組織血管化，然后將血管化的組織移植到受區(qū)，或者將構建的組織工程骨內(nèi)植入動靜脈也能明顯促進材料細胞復合物的血管化及成骨能力，但過程比較復雜，并且即便采用了這些方法，組織工程骨植入受區(qū)后，尤其是早期的血液供應仍然靠滲透進行，沒有完全解決血管化的難題。

4、r>　　 本課題組前期所研發(fā)的異種脫細胞骨基質(zhì)(Acellular bone matrix，ACBM)支架材料較好地保留了細胞外骨基質(zhì)的主要成分和完整結構，并且采用層層自組裝技術，將肝素、殼聚糖復合在其表面，實驗證明緩釋、抗凝效果可靠；然后在此基礎上聯(lián)合封閉負壓吸引技術(Vacuum Assisted closure，VAC)，使血液在早期即可在支架材料內(nèi)部實現(xiàn)持續(xù)“灌注”，為構建的組織工程骨即時、持續(xù)提供氧和營養(yǎng)物質(zhì)。以兔和豬骨缺損

5、為模型的修復研究結果證實，HC/ACBM(Heparin-Chotison coated ACBM)材料結合封閉負壓技術使骨缺損修復支架材料植入后即刻可以獲得血液灌注，與非負壓側比較，血容量、血流量及新生血管數(shù)等均顯著增多，并且能促進新骨形成。
　　 但是，兔和豬和人差別較大，對于這種異種來源的支架材料應用于人還有待進一步研究。而恒河猴的解剖結構、生理學等方面與人高度相似，是一種較為理想的實驗動物，為進一步驗證其安全性和有效性，

6、本實驗首先按照ISO10993的標準檢測了這種新材料的安全性和組織相容性的系列指標，并且在體外研究了模擬負壓吸引灌注條件下培養(yǎng)對種子細胞與支架材料復合的影響，建立了恒河猴脛骨缺損的動物模型，初步探討了HC/ACBM支架材料聯(lián)合負壓吸引對骨缺損修復過程中血流灌注和成骨的影響，為下一步的臨床研究提供理論和實驗依據(jù)。
　　 材料與方法:
　　 1.HC/ACBM的生物安全性試驗
　　 將本課題組研制的HC/ACBM材料

7、按照ISO10993的標準，制作了20％的HC/ACBM的浸提液進行了急性、亞急性毒理試驗、細胞毒性試驗、皮膚刺激性試驗，以及HC/ACBM的肌肉埋植試驗。
　　 對骨髓來源間充質(zhì)干細胞(mensenchymal stem cell，MSC)進行分離、培養(yǎng)，然后將HC/ACBM與細胞進行共培養(yǎng)，對表面改良后的材料與MSC的粘附性進行了研究。
　　 2.負壓吸引灌注培養(yǎng)方式對細胞與材料復合的影響
　　 制作了體外模

8、擬負壓吸引進行細胞與材料共培養(yǎng)的灌注裝置，以自制的這種裝置將MSC和HC/ACBM共培養(yǎng)，對比研究了負壓吸引灌注培養(yǎng)與靜態(tài)培養(yǎng)對MSC的粘附、分布、生存、增殖等方面的影響。
　　 3.HC/ACBM結合負壓吸引修復恒河猴脛骨缺損
　　 建立恒河猴脛骨缺損的模型，以雙側自體作為對照，分別觀察了ACBM支架材料抗凝與不抗凝的比較，以及HC/ACBM聯(lián)合負壓吸引與不聯(lián)合負壓吸引的比較。利用CT及CT灌注觀察了支架材料在修復后不

9、同時間點的血流灌注和成骨情況。
　　 主要結果和結論：
　　 1.掃描電鏡顯示的超微結構表明，表面改良后的HC/ACBM仍保留了天然骨的多孔三維結構，并且HC/ACBM與MSC仍能緊密的粘附，證實HC/ACBM具有很好的粘附性。
　　 2.各項安全性檢測均證實HC/ACBM無明顯的毒性，具有良好的安全性和組織相容性。
　　 3.負壓吸引灌注培養(yǎng)組與靜態(tài)培養(yǎng)組的比較研究表明，負壓吸引灌注培養(yǎng)條件下，細胞在材

10、料表面和中心分布的更加均勻，TUNEL法檢測沒有發(fā)現(xiàn)粘附在材料上的細胞有明顯的凋亡發(fā)生，Brdu法檢測結果表明細胞與材料共培養(yǎng)時細胞可以正常進行增殖。
　　 4.CT灌注成像顯示，HC/ACBM時間密度曲線呈血液灌注的表現(xiàn)，而ACBM材料呈血液滲透曲線。血容量、血流量圖象顯示體內(nèi)植入HC/ACBM這種抗凝材料修復骨缺損，不僅材料周邊部分有血液灌注，材料中心出現(xiàn)血液的時間也明顯早于非抗凝材料；
　　 5.利用填充床式生物反