葡萄球菌耐甲氧西林的調(diào)控機(jī)制及快速檢測(cè)葡萄球菌的研究.pdf

1、目的：1.了解臨床分離的耐甲氧西林葡萄球菌攜帶的mecR1和mecI基因的突變?nèi)笔闆r,并比較這種突變?nèi)笔闆r在金黃色葡萄球菌和凝固酶陰性葡萄球菌中的差別. 2.mecR1和mecI基因的突變?nèi)笔?duì)mecA基因表達(dá)和甲氧西林耐藥表型的影響. 3.建立應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)mecA基因表達(dá)的方法,并探討mecA基因的表達(dá)水平與甲氧西林耐藥水平的關(guān)系. 4.建立應(yīng)用普通PCR和免疫捕獲PCR檢測(cè)陽(yáng)性血培養(yǎng)瓶中葡

2、萄球菌的方法. 方法：1.以PCR法檢測(cè)臨床分離的葡萄球菌是否攜帶mecA基因,以苯唑西林瓊脂稀釋法測(cè)定各菌株的苯唑西林MIC值. 2.以特異引物分別擴(kuò)增mecR1基因的兩個(gè)重要功能區(qū)MS區(qū)和PB區(qū)來(lái)檢測(cè)mecR1基因的存在和缺失情況;以特異引物擴(kuò)增mecI基因來(lái)檢測(cè)其存在和缺失情況,并對(duì)完整的mecI基因測(cè)序來(lái)觀察其突變情況. 3.根據(jù)NCBI上提交的mecA基因和16SrRNA基因序列設(shè)計(jì)特異引物,以實(shí)時(shí)熒光

3、RT-PCR相對(duì)定量的方法檢測(cè)mecA基因表達(dá). 4.普通PCR.檢測(cè)陽(yáng)性血培養(yǎng)瓶中的葡萄球菌采用3對(duì)引物:第一對(duì)引物用來(lái)檢測(cè)16SrRNA基因以確定是否為葡萄球菌,第二對(duì)引物用來(lái)檢測(cè)ssa基因以確定是否為金黃色葡萄球菌,第三對(duì)引物用來(lái)檢測(cè)mecA基因以確定是否為耐甲氧西林葡萄球菌. 5.免疫捕獲PCR法檢測(cè)金黃色葡萄球菌的方法如下:先以人IgG包被PCR管捕獲陽(yáng)性血培養(yǎng)瓶中的金黃色葡萄球菌,然后檢測(cè)ssa基因加以確認(rèn),

4、最后檢測(cè)mecA基因以確定是否為耐甲氧西林金黃色葡萄球菌. 6.以常規(guī)方法為"金標(biāo)準(zhǔn)",評(píng)價(jià)普通PCR法和免疫捕獲PCR法檢測(cè)葡萄球菌的靈敏度和特異度. 結(jié)果：1.在收集到的葡萄球菌中,有155株攜帶mecA基因,其中金黃色葡萄球菌60株、表皮葡萄球菌58株和溶血葡萄球菌37株.兩對(duì)引物檢測(cè)金黃色葡萄球菌中攜帶的mecA基因的結(jié)果相同,但在兩種凝固酶陰性的葡萄球菌中,兩對(duì)引物檢測(cè)mecA基因的結(jié)果有所不同,在6株表皮葡萄

5、球菌和4株溶血葡萄球菌中,以引物mecA2-F、mecA2-R檢測(cè)到mecA基因但以引物mecA1-F、mecA1-R未檢測(cè)到. 2.瓊脂稀釋法檢測(cè)苯唑西林MIC的結(jié)果顯示:在60株攜帶mecA基因的金黃色葡萄球菌中,有58株的苯唑西林MIC值≥4μg/ml,但有2株的苯唑西林MIC值僅為1μg/ml和2μg/ml;95株攜帶mecA基因的凝固酶陰性葡萄球菌的苯唑西林MIC值≥1μg/ml. 3.mecR1基因的檢測(cè)結(jié)果

6、顯示:三種葡萄球菌(金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和溶血葡萄球菌)攜帶的mecR1基因MS區(qū)的百分率分別為83.3﹪、63.8﹪和16.2﹪,經(jīng)X<'2>檢驗(yàn)三種葡萄球菌攜帶mecR1基因MS區(qū)的百分率有差別(X<'2>=43.513,P<0.001),其中金黃色葡萄球菌攜帶mecR1基因MS區(qū)的百分率要高于溶血葡萄球菌(X<'2>=42.249,P<0.001),表皮葡萄球菌攜帶mecR1基因MS區(qū)的百分率要高于溶血葡萄球菌(X<'2>

7、=20.638,P<0.001),但尚不能認(rèn)為金黃色葡萄球菌與表皮葡萄球菌在攜帶mecR1基因MS區(qū)的百分率有差別(X<'2>=5.814,P=0.016).三種葡萄球菌攜帶mecR1基因PB區(qū)的百分率分別為71.7﹪、27.6﹪和5.4﹪,經(jīng)X<'2>檢驗(yàn)三種葡萄球菌攜帶mecR1基因PB區(qū)的百分率有差別(X<'2>=47.481,P<0.001),其中金黃色葡萄球菌攜帶mecR1基因PB區(qū)的百分率要高于表皮葡萄球菌(X<'2>=22

8、.922,P<0.001),表皮葡萄球菌攜帶mecR1基因PB區(qū)的百分率要高于溶血葡萄球菌(X<'2>=7.237,P=0.007),金黃色葡萄球菌攜帶mecR1基因PB區(qū)的百分率要高于溶血葡萄球菌(X<'2>=40.404,P<0.001).綜合MS區(qū)和PB區(qū)的檢測(cè)結(jié)果,經(jīng)X<'2>檢驗(yàn),三種葡萄球菌攜帶完整mecR1基因在總體上有差別(X<'2>=49.291,P<0.001),其中金黃色葡萄球菌攜帶完整mecR1基因的百分率要高于

9、表皮葡萄球菌(X<'2>=26.836,P<0.001),金黃色葡萄球菌攜帶完整.mecR1基因的百分率也高于溶血葡萄球菌(X<'2>=38.529,P<0.001),但尚不能認(rèn)為表皮葡萄球菌與溶血葡萄球菌攜帶完整mecR1基因的百分率有差別(X<'2>=4.915,P=0.027>0.0125). 4.mecl基因的檢測(cè)結(jié)果顯示:在155株葡萄球菌中,mecl基因突變?nèi)笔闆r十分常見(jiàn),攜帶野生型mecl基因的僅有14株(9﹪)

10、.共檢測(cè)到mecI基因的突變位點(diǎn)4個(gè),分別為43位點(diǎn)(G→T)、163位點(diǎn)(A→T)、202位點(diǎn)(C→T)和343位點(diǎn)(G→T),其中以202位點(diǎn)最為常見(jiàn),有36株(占83.7﹪):52株葡萄球菌攜帶的mecI基因中有兩種不同長(zhǎng)度的不完整ISll82片段插入;有46株葡萄球菌的mecl基因缺失. 5.實(shí)時(shí)熒光PCR相對(duì)定量檢測(cè)60株葡萄球菌中mecA基因的表達(dá)后分析顯示,meca基因的表達(dá)與葡萄球菌對(duì)甲氧西林的耐藥水平并無(wú)直接相

11、關(guān)性. 6.在493例血培養(yǎng)陽(yáng)性報(bào)警瓶中,用常規(guī)方法檢測(cè)到葡萄球菌214株,其中有MRS172株;用普通PCR法共檢測(cè)到金黃色葡萄球菌22株和凝固酶陰性葡萄球菌189株,其中MRSA10株、MRCNS134株;免疫捕獲PCR法共檢測(cè)到金黃色葡萄球菌22株,其中MRSA 10株.以常規(guī)方法為"金標(biāo)準(zhǔn)",普通PCR法檢測(cè)葡萄球菌的的靈敏度為98.6﹪,特異度為100﹪;免疫捕獲PCR法檢測(cè)金黃色葡萄球菌的靈敏度和特異度均為100﹪.

12、 結(jié)論：1.在臨床分離的金黃色葡萄球菌中,誘導(dǎo)基因mecR1可能是mecA基因表達(dá)的主要誘導(dǎo)因素;在臨床分離的凝固酶陰性葡萄球菌中,由于誘導(dǎo)基因mecR1缺失嚴(yán)重,mecA基因表達(dá)的誘導(dǎo)則可能主要來(lái)自mecR1基因以外的因素. 2.在臨床分離的耐甲氧西林葡萄球菌中,mecI基因的缺失突變可能是造成mecA基因表達(dá)的重要原因,但攜帶野生型mecI基因的菌株仍能表達(dá)pbp2a說(shuō)明在某些葡萄球菌甚至在整個(gè)葡萄球菌中可能存在一種