細胞工程學實驗課件

1、細胞工程學實驗內(nèi)容 ★ 實驗一 植物細胞培養(yǎng)基的種類及配制 ★ 實驗二 植物愈傷組織的誘導 ★ 實驗三 植物愈傷組織細胞的培養(yǎng),實驗一 植物細胞培養(yǎng)基的種類及配制 一、實驗目的 1、了解植物細胞培養(yǎng)基的種類及營養(yǎng)要求。 2、掌握MS培養(yǎng)基的配制方法。二、實驗材料 1、實驗設(shè)備：高壓滅菌鍋、電子分析天平、pH計、超凈

2、 工作臺。 2、實驗器材：電磁爐、燒杯、量筒、攪拌棒、吸量管、 移樣槍。,三、植物細胞培養(yǎng)基的種類 在100多年的植物組織、器官和細胞離體培養(yǎng)研究中，研制開發(fā)了數(shù)十種適宜不同植物、不同組織、不同細胞生長發(fā)育的培養(yǎng)基配方，但多數(shù)培養(yǎng)基是在幾種普遍應用的培養(yǎng)基上演變而來的，其中應用最為廣泛的仍為MS培養(yǎng)基。植物組織培養(yǎng)基早期

3、的建立，如White提出的根培養(yǎng)基和Gautheret提出的愈傷組織培養(yǎng)基，都是由先前的用于整體植物栽培的營養(yǎng)液發(fā)展而來的。以后所有的各種培養(yǎng)基又都是在White培養(yǎng)基和Gautheret培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上形成的。各種培養(yǎng)基在無機營養(yǎng)組成上的差異主要是鹽和離子數(shù)量上的不同。常用培養(yǎng)基中根據(jù)無機鹽的含量可以分為4類，分述于下：,1、高無機鹽含量培養(yǎng)基：高無機鹽含量培養(yǎng)基中，鉀鹽、銨鹽及硝酸鹽含量較高，微量元素種類齊全，養(yǎng)分數(shù)量及比例較合適，廣

4、泛用于植物的器官、花藥、細胞及原生質(zhì)體的培養(yǎng)。主要有MS培養(yǎng)基和ER培養(yǎng)基。 2、較高硝酸鉀含量培養(yǎng)基：較高硝酸鉀含量培養(yǎng)基適合于木本植物、十字花科植物和單子葉植物的組織和花藥培養(yǎng)。主要有B5培養(yǎng)基和N6培養(yǎng)基。,3、中等無機鹽含量培養(yǎng)基：中等無機鹽含量培養(yǎng)基中，大量元素約為MS培養(yǎng)基的一半，微量元素種類減少，但含量較MS的高，適合于花藥培養(yǎng)。主要有Nitsch培養(yǎng)基和NT培養(yǎng)基。 4、低無機鹽含量培養(yǎng)基

5、：低無機鹽量培養(yǎng)基中，大量元素含量大幅降低而且種類減少，多數(shù)用于生根培養(yǎng)基。主要有White培養(yǎng)基和Heller培養(yǎng)基。各種植物培養(yǎng)基的營養(yǎng)組成及配方如下表：,四、MS培養(yǎng)基的配制 植物細胞培養(yǎng)基種類很多，如MS、ER、B5、N6、NT和White等。本實驗以MS完全培養(yǎng)基為例，介紹植物細胞培養(yǎng)基的配制方法。 （一）MS培養(yǎng)基母液的配制 母液的配制是按藥品的種類和性質(zhì)分別配制，單獨保存或

6、幾種混合保存。配制好的母液種類一般有大量元素、微量元素、鈣鹽、鐵鹽、有機營養(yǎng)和單獨保存的各種生長調(diào)節(jié)類物質(zhì)。大量元素一般配制成10倍濃度的母液，微量元素和有機物常配制成100倍濃度的母液。見下表。,上表提供了MS培養(yǎng)基母液的配方。將各種化合物按指定擴大倍數(shù)準確稱量、分別溶解后，按先后次序加入蒸餾水中，最后用蒸餾水定容。 注意：在混合定容時，一定要掌握藥劑的先后次序或稀釋度，以免發(fā)生沉淀。鈣鹽和鐵鹽由于與其它母液混合容易發(fā)

7、生沉淀反應，因此需單獨配制。鐵鹽為螯合狀態(tài)時，有利于植物在適宜的pH下吸收和利用，因此需與螯合劑Na2·EDTA混合配制。生長調(diào)節(jié)類物質(zhì)一般分別配制成0.2~1.0mg/L的母液，用時按量吸取。某些生長調(diào)節(jié)劑不溶于水，需用不同溶劑進行溶解，如NAA、2,4-D、IAA、IBA、GA3是醇溶性的，配制時先用少量95%酒精溶解，然后再用蒸餾水定溶；KT、6-BA、2ip、ZT先溶于少量1mol/L鹽酸中，然后再用蒸餾水定容；葉酸先

8、用少量稀氨水溶解后再定容。 配制好的各種母液倒入棕色瓶中，貼好標簽，保存于4℃冰箱中備用。注意：母液保存于冰箱中的時間不宜過長，一般為1~2個月，當母液出現(xiàn)沉淀或霉菌團時，則不能再使用。,（二）MS完全培養(yǎng)基的配制 以配制1 000mL MS完全培養(yǎng)基為例，配制全過程如下： 1、在潔凈的不銹鋼（或搪瓷）容器中加入1/2終體積 （500mL）的蒸餾水； 2、

9、按上表內(nèi)容規(guī)定的量，精確吸取各種母液，依次加入到 盛有1/2終體積蒸餾水的不銹鋼（或搪瓷）容器中，記錄 此時的總體積。注意：母液不能混合后加入，也不能同 時加入，必須依次緩慢加入，且要一邊加入一邊攪拌， 以免造成電解質(zhì)局部濃度過高而發(fā)生沉淀反應； 3、根據(jù)培養(yǎng)目的及要求，加入所需量的各種生長調(diào)節(jié)物 質(zhì)，記錄此時的總體積（如用于長春

10、花葉愈傷組織的誘 導：加入2,4-D 1.0mg/L、6-BA 0.5mg/L、 NAA 1.0mg/L、 KT 0.2mg/L）；,4、加入30g蔗糖，5g聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone， PVP，抗氧化劑，防止或減輕植物組織褐化，也可用一定 量的維生素C、活性碳代替，或不加，視情況而定），充 分混勻后，補充蒸餾水至終體積1 000

11、mL，然后用1mol/L 鹽酸或1mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)培養(yǎng)基至pH5.8；5、精確稱取15g瓊脂加入其中，在電磁爐上煮沸溶解瓊脂。此 過程需加以攪拌，防止瓊脂在鍋底燒焦或沸騰溢出；6、瓊脂溶解后，及時將培養(yǎng)基分裝于150mL三角瓶中，約 50mL/瓶，包膜密封，并于100KPa、121℃下滅菌15~20分 鐘。冷卻備用。,注意：培養(yǎng)基的pH直接影響培養(yǎng)物對離子的吸收，過酸或過堿不僅影

12、響到培養(yǎng)材料的生長，而且還影響到瓊脂的凝固，pH低于5.5時，瓊脂凝固程度不好，pH高于6.0時，瓊脂過度凝固，培養(yǎng)基變硬，不利于培養(yǎng)材料對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收及對代謝廢物的排放，從而影響培養(yǎng)材料的生長。培養(yǎng)基的pH可用酸度計測試，并用1mol/L鹽酸或1mol/L氫氧化鈉調(diào)整至適宜范圍（1mol/L鹽酸配制方法：取12mol/L HCl 84mL，加入蒸餾水定容至1 000mL；1mol/L氫氧化鈉配制方法：稱40g NaOH，溶解后加入蒸

13、餾水，定容至1 000 mL）。培養(yǎng)的植物材料其生長最適pH范圍為5.6~6.0，培養(yǎng)基經(jīng)高壓高溫滅菌后，由于某些成分的降解或氧化，酸度會增加，pH一般可降低0.2，因此配制植物培養(yǎng)基時，通常調(diào)整pH至5.8。,對于某些不能高壓高溫滅菌的試劑或藥品，必須過濾除菌，待培養(yǎng)基滅菌后未凝固之前（45~60℃）加入，并輕搖使混勻。這時，每個培養(yǎng)容器的裝入量和過濾除菌后的物質(zhì)都要事先計算好，定量加入其中。植物培養(yǎng)基的配制程序可用流程圖表示如下：,

14、水 藥品 混勻 pH調(diào)整 瓊脂 加熱溶解 糖 玻璃器皿 水洗 干燥 分裝 密封

15、 接種 冷卻 高溫蒸汽滅菌,,,,,,,,,,,,,,,,實驗二 長春花葉片愈傷組織的誘導一、實驗目的 通過對長春花葉片愈傷組織的誘導，分析生長素和細胞分裂素對長春花葉片離體培養(yǎng)的作用，熟練掌握植物組織離體培養(yǎng)培的基本操作技術(shù)，了解植物組織在離體培養(yǎng)條件下脫分化的條件及特點。二、實驗原理 根據(jù)植物細胞全能性理論，利用MS培養(yǎng)基，加

16、入一定濃度的生長素和細胞分裂素對長春花葉片組織進行培養(yǎng)，在光照或黑暗條件下均可誘導長春花葉片組織發(fā)生脫分化而產(chǎn)生愈傷組織，這已經(jīng)在許多植物的組織培養(yǎng)中得到證實，甚至在一些低等植物（如葫蘆蘚）中也得到了證實。,三、實驗材料 1、實驗設(shè)備：超凈工作臺、高壓滅菌鍋、pH計、光照培養(yǎng) 箱、暗培養(yǎng)箱。 2、實驗器材：三角瓶（150 mL）、棕

17、色瓶（100 mL， 500 mL，1000 mL）、長柄鑷子、塑料燒杯（500 mL，l000 mL）、玻璃燒杯（100 mL、500 mL，l000 mL）、量筒（100 mL，500mL，

18、 1000 mL）、培養(yǎng)皿（∮=12 cm）、手術(shù)刀。 3、實驗試劑：萘乙酸（Napthylacetic acid，NAA）、6-芐基 氨基嘌呤（6-Benzylamino purine，6-BA）、 2，4-二氯苯氧

19、乙酸（2，4- Dichlorophenoxyacetic acid，2，4-D）、KT （kinetin，KT）、升汞（HgCl）、次 氯酸鈉 溶液、95%酒精、蔗糖（Sucrose）、瓊脂

20、 （Agar）、MS基本培養(yǎng)基母液。,4、試劑配制： （1）MS基本培養(yǎng)基母液：見實驗一MS培養(yǎng)基配方表。 （2）1 mol/L NaOH：將40g NaOH溶解在1升蒸餾水中， 攪拌均勻。 （3）1 mol/L HCl：用蒸餾水將12mol/L的濃鹽酸稀釋12

21、 倍。 （4）生長調(diào)節(jié)劑母液： ① 0.2 mg/mL萘乙酸（NAA）溶液：精確稱取20mg 萘乙酸，用少量1 mol/L NaOH溶解后，用蒸餾水 稀釋并定容到100 ml。 ② 0.2 mg

22、/mL 2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）溶液：精 確稱取20 mg 2,4-二氯苯氧乙酸，用少量1 mol/L 的NaOH溶解后，用蒸餾水稀釋并定容到100ml。,③ 0.2 mg/mL 6-芐氨基嘌呤（6-BA）溶液：精確稱取20 mg 6-芐基氨基嘌呤，用少量1 mol/L的HCl溶解后，

23、 用水稀釋并定容到100ml。 ④ 0.1 mg/mL KT（kinetin，KT）溶液：精確稱取10 mg KT，用少量1 mol/L的HCl溶解后，用水稀釋并定容 到100ml。 （5）75％的消毒酒精：精確量取75ml無水乙醇溶于100ml 蒸餾水中。 （6）0.1%升汞（HgCl）溶液：精確稱取1 g HgCl，

24、用蒸餾 水溶解并定容到1 000ml，盛裝于棕色試劑瓶中避光保 存。 （7）10%次氯酸鈉溶液：精確量取100ml次氯酸鈉溶液 溶，用蒸餾水溶解并定容到1 000ml，盛裝于棕色試劑 瓶中避光保存。 5、實驗用植株：長春花幼苗。,四、實驗步驟 1、MS完全培養(yǎng)基的配制： （1）將各種貯液按比例混合，配制

25、成MS培養(yǎng)基（具體操 作見實驗一）； （2）分別加入2,4-D 1.0mg/L、6-BA 0.5mg/L、 NAA 1.0mg/L、KT 0.2mg/L（此激素配方只適用于長春 花葉片愈傷組織的誘導。對于不同植物的外植體來 說，影響其脫分化的激素種類和用量是不一樣的，

26、 必需通過正交試驗來篩選才能獲得最佳配方）；,（3）培養(yǎng)基中加入3％蔗糖，完全溶解后加蒸餾水至終體 積； （4）用l N的NaOH調(diào)整培養(yǎng)基至pH 5.8； （5）加入15g/L瓊脂，將培養(yǎng)基置電磁爐上煮沸至瓊脂完全 溶解，然后分裝到150ml三角瓶中，每瓶約70 ml，用 封口膜包扎瓶口； （6）將三

27、角瓶放入高壓滅菌鍋，于121℃、100KPa下滅菌 15~20 min。待壓力下降為零，溫度降低到105℃以 下，打開放氣閥排氣后，取出三角瓶，平放冷卻備用； （7）按上述方法高壓滅菌蒸餾水、空三角瓶、培養(yǎng)皿（帶 濾紙）及其它相關(guān)用具。,2、外植體的表面消毒與接種培養(yǎng)： （1）取長春花完全展開的幼葉，用自來水流水沖洗1~2 h；

28、（2）在超凈工作臺上用無菌水將葉片洗滌2~3次，每次1 min，然后浸于含75％酒精的無菌三角瓶中輕搖30s， 再移入0.1％升汞溶液中輕搖5~8 min或10％的次氯酸鈉 溶液中輕搖8~10 min（消除外植體表面的微生物）， 無菌水洗滌3~5次（消毒液對外植體有很大傷害，必須 清洗干凈），每次3 mi

29、n；,（3）將消毒后的長春花葉片置于無菌培養(yǎng)皿內(nèi)（有無菌濾 紙），用手術(shù)刀將無菌葉片切成5mm×5 mm大小； （4）將適宜大小的外植體接種到培養(yǎng)基上，每個三角瓶中接 入3~4塊葉外植體； （5）將接種好的三角瓶置于光培養(yǎng)箱（光周期為：光照16 h 和黑暗8 h，光照強度約l500 lx左右）或暗培養(yǎng)箱內(nèi)的培

30、 養(yǎng)架上，培養(yǎng)溫度為26±1℃； （6）每天觀察培養(yǎng)情況，記錄結(jié)果。如：接種培養(yǎng)后，外植 體（培養(yǎng)材料）在形態(tài)學上的變化情況，愈傷組織開始 出現(xiàn)時間、愈傷組織誘導率、形態(tài)、生長速率、顏色變 化及質(zhì)地等指標。預期結(jié)果見圖2-1。,,【思考題】 1、影響長春花葉外植體脫分化的條件及特點是什

31、 么？ 2、對于同一物種的不同組織來說，其愈傷組織誘 導條件是否一樣？為什么？,實驗八 植物愈傷組織細胞的傳代培養(yǎng)一、實驗目的 1、  掌握植物愈傷組織細胞傳代培養(yǎng)的原理及操作方法。 2、 了解植物細胞培養(yǎng)的意義。二、實驗原理 和動物細胞傳代培養(yǎng)一樣，植物細胞傳代培養(yǎng)也是組織培養(yǎng)的常規(guī)保種方法之一，是幾乎

32、所有細胞生物學實驗的基礎(chǔ)。當細胞在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)時，細胞不斷生長增殖，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分逐漸耗盡，同時也積累大量的代謝廢物，從而反饋抑制細胞的生長，甚至導致細胞褐化而死。這時需要進行分離培養(yǎng)，否則細胞會因生存空間不足，營養(yǎng)障礙，生長條件惡化而死亡。細胞由原培養(yǎng)瓶內(nèi)分離后轉(zhuǎn)到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)的過程稱為傳代培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)可獲得大量細胞供實驗或生產(chǎn)所需。,三、實驗材料 1、實驗設(shè)備：超凈工作臺、pH計、高壓滅菌鍋、生化培

33、 養(yǎng)養(yǎng)箱。 2、實驗器材：三角瓶（150 mL）、棕色瓶（100 mL， 500 mL，1000 mL）、長柄鑷子、塑料燒 杯（500 mL，l000 mL）、玻璃燒杯（100

34、 mL、500 mL，l000 mL）、量筒（100 mL，500 mL，1000 mL）、培養(yǎng)皿 （∮=12 cm）、手術(shù)刀。 3、實驗試劑：萘乙酸（Napthylacetic acid，NAA）、6-

35、 芐基氨基嘌呤（6-Benzylamino purine，6- BA）、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4- Dichlorophenoxyacetic acid，2，4-D）、 KT（kinetin，KT）、95%酒精、

36、蔗糖 （Sucrose）、瓊脂（Agar）、MS基本培 養(yǎng)基母液。,4、生長調(diào)節(jié)劑母液： ① 0.2 mg/mL萘乙酸（NAA）溶液：精確稱取20mg萘乙 酸，用少量1 mol/L NaOH溶解后，用蒸餾水稀釋并定 容到100 ml。

37、 ② 0.2 mg/mL 2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）溶液：精確稱取 20 mg 2,4-二氯苯氧乙酸，用少量1 mol/L的NaOH溶解 后，用蒸餾水稀釋并定容到100ml。 ③ 0.2 mg/mL 6-芐氨基嘌呤（6-BA）溶液：精確稱取20 mg 6-芐基氨基嘌呤，用少量1 mol/L的HCl溶解后，用

38、 水稀釋并定容到100ml。 ④ 0.1 mg/mL KT（kinetin，KT）溶液：精確稱取10 mg KT，用少量1 mol/L的HCl溶解后，用水稀釋并定容到 100ml。,5、75％的消毒酒精：精確量取75ml無水乙醇溶于100ml蒸 餾水中。 6、實

39、驗材料：長春花葉片愈傷組織細胞。,四、實驗步驟 1、MS完全培養(yǎng)基的配制： （1）將各種貯液按比例混合，配制成MS培養(yǎng)基（具體操 作見實驗一）； （2）分別加入2,4-D 0.5mg/L、6-BA 0.5mg/L、 NAA 0.5mg/L、KT 0.3mg/L（此激素配方只適用于長春花

40、葉片愈傷組織細胞的生長。對于不同的愈傷組織細胞 來說，影響其生長的激素種類和用量是不一樣的，必 需通過正交試驗來篩選才能獲得最佳配方）；,（3）培養(yǎng)基中加入3％蔗糖，完全溶解后加蒸餾水至終體 積； （4）用l N的NaOH調(diào)整培養(yǎng)基至pH 5.8； （5）加入15g/L瓊脂，將培養(yǎng)基置電磁爐上煮沸至瓊脂完全溶

41、 解，然后分裝到150ml三角瓶中，每瓶約50 ml，用封口 膜包扎瓶口； （6）將三角瓶放入高壓滅菌鍋，于121℃、100KPa下滅菌 15~20 min。待壓力下降為零，溫度降低到105℃以下， 打開放氣閥排氣后，取出三角瓶，平放冷卻備用； （7）按上述方法高壓滅菌蒸餾水、空三角瓶、培養(yǎng)皿（帶濾

42、 紙）及其它相關(guān)用具。,2、外植體的接種與培養(yǎng)： （1）用長柄鑷子取新鮮的長春花葉片愈傷組織細胞，接種 到新鮮培養(yǎng)基表面，每瓶3~4塊（每塊愈傷組織的大小 約為3mm×3 mm，重約0.5g）； （2）將接種好的三角瓶置于生化培養(yǎng)箱中進行暗培養(yǎng)，培 養(yǎng)溫度為26±1℃；

43、 （3）每天觀察培養(yǎng)情況，記錄結(jié)果。如：傳代培養(yǎng)后，外 植體在形態(tài)學上的變化情況，愈傷組織細胞的生長速 率、顏色變化及質(zhì)地等指標。,注意：植物細胞的傳代培養(yǎng)常采用新鮮、疏松、生長良好的愈傷組織細胞作為外植體，一般為白色或淺黃色，用鑷子比較容易分離。但是，有些植物的愈傷組織細胞生長致密（如長春花愈傷組織細胞），用鑷子不易分離。因此，接種時先轉(zhuǎn)入無菌培養(yǎng)皿中，再用手術(shù)刀將其

44、切成3mm×3 mm的愈傷組織塊，然后接種于新鮮培養(yǎng)基中，每瓶3~4塊。 培養(yǎng)過程見圖2-2和圖2-3。,,圖2-1 長春花愈傷組織誘導結(jié)果A：葉愈傷組織B：莖愈傷組織 C：花蕊愈傷組織注：以上結(jié)果均于MS培養(yǎng)基上暗培 養(yǎng)，誘導時間為24d。,C,B,A,,圖2-2 長春花葉片愈傷組織細胞 MS培養(yǎng)基暗培養(yǎng)28d 接種量：

45、0.83±0.02g 鮮重增長量：9.04±1.03g 增長倍數(shù)：10.84倍,圖2-3 長春花花蕊愈傷組織細胞 MS培養(yǎng)基暗培養(yǎng)28d 接種量： 0.45±0.34g 鮮重增長量： 9.07±0.93g 增長倍數(shù)：