細胞工程實驗總結

1、1實驗一、細胞培養(yǎng)實驗器材和試劑的準備1、哪些物品適合于高壓滅菌，并說明理由。①材料：微孔濾膜(直徑25cm)：孔徑為0.22μm、微孔濾膜(直徑90cm)：孔徑為0.22μm、過濾器(直徑25cm)。②儀器和器材：眼科剪刀和鑷子、長鑷子、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶、試劑瓶（或鹽水瓶）、移液槍、10毫升試管、10毫升離心管、巴氏吸管、5毫升（或10毫升）吸量管、不銹鋼過濾器、塑料過濾器、注射器、超凈工作臺、干燥箱、高壓滅菌鍋、正壓泵。理由：適合于高

2、壓滅菌是布類、橡膠制品(如膠塞)、金屬器械、玻璃器皿、某些耐高溫的塑料制品以及加熱后不發(fā)生沉淀的無機溶液(如Hanks液、PBS等)。2、細胞培養(yǎng)常用液體如何配制和滅菌？1）PBS：8.0gNaCl、0.2gKCl、2.2gNa2HPO4、0.12gKH2PO4溶于1000mL雙蒸水，高壓滅菌，4℃保存。（準備試劑瓶）滅菌方法：高壓滅菌。2）干粉培養(yǎng)基過濾除菌（先準備好不銹鋼過濾器及濾膜，安裝后高壓滅菌，適度烘干；鋁盒4個，三角瓶2個，

3、容量瓶，不銹鋼過濾器一套，酒精燈，酒精棉球3瓶，吸耳球3個，吸量管10毫升和5毫升各5根，分裝用瓶，血清，超純水，抗生素）認真閱讀說明書。說明書都注明干粉不包含的成分，常見的有NaHCO3、谷氨酰胺、丙酮酸鈉、HEPES等。這些成分有些是必須添加的，如NaHCO3、谷氨酰胺，有些根據實驗需要決定。配制方法（1L）：1）在一個盡可能接近總體積的容器中加入大約500mL雙蒸水。2）在室溫（20℃到30℃）的水中加入干粉培養(yǎng)基。3）水洗袋內殘

4、留培養(yǎng)基，全部轉移到容器內，輕輕攪拌，不要加熱。4）完全溶解之后，1袋1L粉狀DMEM加3.7gNaHCO3，1mmoL∕L丙酮酸鈉，即0.11gL，添加雙抗。5）用雙蒸水定容到1L，攪拌溶解。注意不要過分攪拌。6）通過緩慢攪拌加入1NNaOH或1NHCL調節(jié)pH值培養(yǎng)基在過濾前要保持密封。7）立刻不銹鋼過濾器過濾除菌，貼上標簽，4℃保存?zhèn)溆?。滅菌方法：高壓滅菌?）胰蛋白酶EDTA消化液①胰蛋白酶溶液配制：稱取胰蛋白酶（1:250）粉

5、末0.25g置燒杯中，溶于100mLPBS，攪拌混勻，置室溫4小時并不斷攪拌振蕩，過濾除菌。（若配制400mL則應稱取1g胰蛋白酶）滅菌方法：過濾除菌。②EDTA溶液配制：0.2gEDTA用400mLPBS溶解后，高壓蒸汽滅菌，分裝成小瓶，4℃冰箱保存。滅菌方法：高壓蒸汽滅菌。胰蛋白酶與EDTA按1：1混合后分裝，4℃冰箱保存。3配的包裝一次使用。(3)溶解干粉培養(yǎng)基時先加入終體積90%－95%的培養(yǎng)用水，添加劑加完后再定容。(4)如需

6、添加的組分較多時，某一組分完全溶解后，再添加另一組分。(5)待培養(yǎng)基完全溶解后再加入碳酸氫鈉。(6)所有成分完全溶解后，培養(yǎng)基應立即過濾或高壓除菌。(7)在過濾前，可將pH調至比所需值低0.10.2個單位。(8)在細胞培養(yǎng)過程中，建議不加或加少量的抗生素，如血清的濃度較低則所加抗生素的量也要相應降低一些。(9)建議用1NHCl或1NNaOH來調節(jié)培養(yǎng)基的pH。8、物品放進飯盒后要貼好標簽，還需要用棉布或牛皮紙包好再貼上標簽。在標簽處包扎

7、好。容器，包括裝PBS的玻璃瓶，瓶口要擰松，不能緊，瓶口包扎牛皮紙，滅菌后立刻擰緊瓶蓋，然后再取出，冷卻后放入冰箱。注意檢測標簽是否脫落。9、根據每個實驗的要求，準備好所需物品，一并放入超凈臺內。實驗器材準備的數量要大于實際使用數，瓶蓋要大于瓶數。要配備至少三套器械（一套使用，一套備用，一套清洗滅菌），循環(huán)使用。10、玻璃瓶、移液管要封閉包扎使用端，標記手持端。實驗二雞胚胎成纖維細胞的原代培養(yǎng)1、如何進行雞胚胎成纖維細胞的原代培養(yǎng)。實驗

8、進行前，準備好相關器材，無菌室及超凈工作臺以紫外燈照射滅菌3060分鐘（溶液同時37℃預熱），然后開啟通風10分鐘后，才開始實驗操作。實驗用品以75%酒精擦拭后才帶入無菌操作臺內。實驗操作應在中央無菌區(qū)域酒精燈火焰旁進行。1、取910日齡的雞胚，用酒精消毒，在超凈工作臺內，小心取出雞胚，放在無菌培養(yǎng)皿中，除去頭尾、四肢及內臟；2、胚體用含雙抗PBS沖洗23次，切成12mm3的小塊，然后轉入容積適量大小的離心管；3、按每個雞胚加入大約5m

9、L的胰酶消化液，在室溫（或37℃）下消化10min，吸管（或槍頭）不停吹打；4、加入含小牛血清培養(yǎng)液終止消化，收集細胞懸液，沒有消化完全的組織塊可再消化一次；5、收集到的細胞懸液經100目過濾篩過濾，1200轉離心5min；離心管用酒精擦拭后拿進超凈臺，擰開蓋子后，管口過火焰兩次，倒出上清，保存管口向下蘸一下干的酒精棉球，再保存管口向下過火焰兩次；6、細胞沉淀用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液重新懸?。?、以5105個mL的密度溶液3.