silac用于蛋白質(zhì)組學(xué)定量

1、SILAC定量蛋白質(zhì)組學(xué),SILAC定量蛋白質(zhì)組學(xué),1：SILAC定量蛋白質(zhì)組學(xué)原理2: 應(yīng)用 2.1：SILAC定量蛋白質(zhì)組學(xué) 2.2: SILAC研究蛋白質(zhì)相互作用 2.3：SILAC研究蛋白質(zhì)與DNA相互作用 2.4：SILAC研究蛋白質(zhì)與RNA相互作用,1：SILAC定量蛋白質(zhì)組學(xué)原理,1.1：SILAC定量蛋白質(zhì)組學(xué)的原理1.2：SILAC技術(shù)流程 1.2.1：培養(yǎng)基準(zhǔn)備

2、 1.2.2：細(xì)胞標(biāo)記與測(cè)試 1.2.3: 實(shí)驗(yàn)處理 1.2.3：蛋白質(zhì)分離與質(zhì)譜分析 1.2.4：結(jié)果形式,SILAC法。 1、標(biāo)記：在缺乏Lys和Arg的培養(yǎng)基中添加Lys和Arg的同位素Lys(D4或13C6 15N4)、Arg(13C6,或13C6 15N4)等培養(yǎng)細(xì)胞，使蛋白質(zhì)被標(biāo)記成“中型”或“重型”； 2、細(xì)胞處理，如藥物處理； 3、細(xì)胞裂解、提取蛋白質(zhì)； 4、等量混合對(duì)照

3、與處理組蛋白質(zhì)、SDS-PAGE電泳、染色； 5、割取蛋白質(zhì)條帶，胰蛋白酶消化，質(zhì)譜分析。,1.1：SILAC定量蛋白質(zhì)組學(xué)原理,1.1：SILAC定量蛋白質(zhì)組學(xué)原理,技術(shù)優(yōu)勢(shì)——目前比較蛋白質(zhì)組學(xué)最先進(jìn)方法 （1）高效性：SILAC是體內(nèi)標(biāo)記技術(shù)，標(biāo)記效率可高達(dá)100%； （2）定量精確：線性范圍廣，降低由于樣品制備不同而造成的實(shí)驗(yàn)內(nèi)差異； （3）高通量、靈敏度高：可同時(shí)鑒定并定量數(shù)百至數(shù)千種蛋白質(zhì)，且檢可

4、測(cè)測(cè)到納克級(jí)水平； （4）相容性：可以對(duì)多種在DMEM或RPMI 1640培養(yǎng)基中能夠培養(yǎng)的細(xì)胞或細(xì)菌中表達(dá)的蛋白進(jìn)行標(biāo)記； （5）靈活性：在缺乏L-賴氨酸和L-精氨酸的培養(yǎng)基中添加同位素標(biāo)記的這兩種氨基酸，操作方便。,1.2.1：培養(yǎng)基準(zhǔn)備,材料： （1）：Lys或（和）Arg缺陷型1640培養(yǎng)基， Lys或（和）Arg缺陷型DMEM培養(yǎng)基。 （2）：透析FBS。 （3）：穩(wěn)定同位素標(biāo)記的Lys和Ar

5、g。L-Lysine(13C6), L-Lysine (13C6,15N2), L-Lysine(13C6,15N2), L-Lysine(15N2,D9), L-Lysine(4,4,5,5-D4) ,L-Arginine(13C6), L-Arginine (13C6, 15N4), L-Arginine(13C6,15N4)。培養(yǎng)基制備： 取相應(yīng)量的穩(wěn)定同位素氨基酸Lys和Arg各50mg,添加到500ml培養(yǎng)基中

6、，同時(shí)添加血清（一般是10%）和抗生素后，0.22um濾膜過(guò)濾，4度保存?zhèn)溆?。根?jù)實(shí)驗(yàn)的需要，可以配制“中”型和“重”型培養(yǎng)基。,1.2.2：細(xì)胞標(biāo)記與測(cè)試,標(biāo)記： 一般細(xì)胞經(jīng)過(guò)添加同位素的培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)5-6代后，一天或2天傳代一次，細(xì)胞中蛋白質(zhì)的Lys和Arg將被同位素氨基酸取代。添加了穩(wěn)定同位素（“中”或“重”型）的細(xì)胞與“輕”型細(xì)胞相比細(xì)胞生長(zhǎng)速度可能偏慢，這是由于透析血清與中缺乏一些鹽成分，可以讓透析血清在PBS里

7、面透析，透析膜的孔徑一般為10KDa.標(biāo)記測(cè)試： 在進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)之前，需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記測(cè)試，測(cè)試細(xì)胞中蛋白質(zhì)的Lys和（或）Arg是否被相應(yīng)的同位素氨基酸取代。收取 蛋白質(zhì)后，等量混合，SDS-PAGE分離，LC-MS/MS檢測(cè)。,1.2.2：細(xì)胞標(biāo)記與測(cè)試,細(xì)胞經(jīng)過(guò)傳代培養(yǎng)7天后，同一肽段被“重”型肽段取代,1.2.3: 實(shí)驗(yàn)處理,當(dāng)標(biāo)記測(cè)試檢測(cè)到蛋白質(zhì)已被同位素氨基酸標(biāo)記后，可以進(jìn)行細(xì)胞處理，如藥物處理，病

8、毒處理等。,1.2.3：蛋白質(zhì)分離與質(zhì)譜分析,（1）：提取“輕”型”，“中”型，“重”型細(xì)胞蛋白質(zhì)，等量混合，SDS-PAGE分離，染色。（2）：割取蛋白質(zhì)條帶，胰蛋白酶酶切。（3）：LC-MS/MS（儀器：LTQ Orbitrap XL?)分析，數(shù)據(jù)檢索。,1.2.4：結(jié)果形式,LC-MS/MS分析結(jié)果，將會(huì)給出每個(gè)肽段的質(zhì)譜峰圖及定量信息。結(jié)果將會(huì)已EXCEL表格呈現(xiàn)。 肽段質(zhì)譜峰圖及表達(dá)量：,2: SILAC應(yīng)用,2.1

9、：SILAC定量蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)例 2.2: SILAC研究蛋白質(zhì)相互作用 2.3：SILAC研究蛋白質(zhì)與DNA相互作用 2.4：SILAC研究蛋白質(zhì)與RNA相互作用,2.1：SILAC定量蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)例,2.1 Schematic for SILAC,SILAC實(shí)驗(yàn)流程圖,2.1 MS spectra showing the four major patterns of phosphorylation observed,SILAC定

10、量結(jié)果圖例，質(zhì)譜峰的高度表示蛋白表達(dá)的相對(duì)強(qiáng)度,. Summary of fold change with Her2 for all 462 proteins, with several individual proteins high-lighted. Proteins with a ratio>1.5(upperred line) are consideredas increased in their tyrosine

11、 phosphorylation level,and those with ratios<0.66 (lowerred line) are considered as decreased in their tyrosine phosphorylation level. In3T3-Her2cells,198 proteins showed significant increases in phosphorylation,

12、and 81 proteins showed a significant decrease,2.1 Quanti?cation of phosphorylation by SILAC,2.1 Conclusion,2.2 SILAC研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用,J. Cell Biol. Vol. 183 No. 2 223–239，2008,2.3 SILAC研究蛋白質(zhì)與DNA相互作用,Genome Res. 2009 19: 284-