基于SILAC技術(shù)的PRRSV感染Marc-145細(xì)胞分泌蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus，PRRSV)引起的造成全球養(yǎng)豬業(yè)嚴(yán)重危害的病毒性傳染病，主要臨床表現(xiàn)為妊娠母豬明顯的繁殖障礙以及仔豬嚴(yán)重的呼吸系統(tǒng)癥狀和生長遲緩。自1987年首次在北美發(fā)現(xiàn)以來，目前已擴(kuò)散至全球各大養(yǎng)豬

2、國，并造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，也成為我國重要的地方流行性疾病之一。目前已知PRRSV誘導(dǎo)炎癥因子的大量表達(dá)和釋放某些蛋白質(zhì)參與免疫炎癥反應(yīng)，例如PRRSV感染Marc-145細(xì)胞和豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAMs)能誘導(dǎo)高遷移率族蛋白1(HMGB1)的釋放，且能增強(qiáng)PRRSV誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。這提示我們細(xì)胞外分泌蛋白也在PRRSV的致病機(jī)理中發(fā)揮很重要的作用。但目前研究都僅基于對個(gè)別已知分泌蛋白的分析，無法對未知分泌蛋白進(jìn)行分析且缺乏整體性。本研究

3、利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析了PRRSV感染Marc-145細(xì)胞和未感染狀態(tài)下分泌蛋白圖譜的差異，通過生物信息學(xué)手段對差異蛋白表達(dá)譜進(jìn)行分析并在功能上驗(yàn)證差異蛋白PRDX3的促炎性因子作用和增強(qiáng)PRRSV誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的作用。具體研究內(nèi)容如下:
　　1.PRRSV感染Marc-145細(xì)胞的分泌蛋白質(zhì)組學(xué)研究
　　利用細(xì)胞培養(yǎng)穩(wěn)定同位素標(biāo)記(stable isotope labeling with amino acids in cel

4、lcultures，SILAC)技術(shù)，配合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)，對PRRSV感染Marc-145細(xì)胞的分泌蛋白表達(dá)情況進(jìn)行了定量檢測和分析。共鑒定出204個(gè)差異表達(dá)蛋白，包括163個(gè)表達(dá)上調(diào)的蛋白和41個(gè)表達(dá)下調(diào)的蛋白。隨后利用生物信息學(xué)技術(shù)對差異表達(dá)分泌蛋白的亞細(xì)胞定位、生物學(xué)功能進(jìn)行了分析，并繪制了互作網(wǎng)絡(luò)圖，發(fā)現(xiàn)PRRSV感染顯著激活了非經(jīng)典分泌途徑，特別是Exosome介導(dǎo)途徑，例如各種DAMPs的釋放。生物學(xué)

5、功能分析發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的蛋白與蛋白結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)、應(yīng)激反應(yīng)調(diào)控、代謝過程和免疫反應(yīng)等多種生物過程相關(guān)。為了驗(yàn)證分泌蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果的可靠性，進(jìn)一步通過Western blot方法對結(jié)果中的4個(gè)差異表達(dá)的蛋白進(jìn)行了檢測，結(jié)果與蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果一致。
　　2.PRDX3誘導(dǎo)炎癥因子的表達(dá)
　　過氧化物酶(peroxiredoxins，Prxs)是一類很重要的內(nèi)源性抗氧化劑。已有報(bào)道顯示，細(xì)胞外的PRDX1作為促炎性因子與TLR4結(jié)合，激活

6、NF-κB，促進(jìn)TNF-α和IL-6的分泌。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)PRRSV感染后促進(jìn)了PRDX3的分泌，繼而對其可能的促炎性因子作用進(jìn)行了研究。首先原核表達(dá)和純化PRDX3，隨后處理PK-15細(xì)胞，通過NF-κB熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)、Western blot實(shí)驗(yàn)、間接免疫熒光和相對定量PCR發(fā)現(xiàn)，PRDX3可以誘導(dǎo)NF-κB的激活、NF-κB p65亞基的磷酸化和入核、IL-6，IL-8和TNF-α等炎癥因子的表達(dá)，說明PRDX3具有促炎性因

7、子的作用。
　　為了探討TLR4是否參與PRDX3誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，將TLR4干擾分子轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞后用PRDX3蛋白處理，通過Real-time PCR檢測發(fā)現(xiàn)干擾TLR4的表達(dá)能抑制PRDX3誘導(dǎo)的IL-6，IL-8和TNF-α等炎癥因子的表達(dá)。此外，利用PRDX3處理TLR4缺失的HEK-293T細(xì)胞則不能誘導(dǎo)NF-κB的激活，而在轉(zhuǎn)染了TLR4超表達(dá)質(zhì)粒的HEK-293T細(xì)胞上PRDX3可以誘導(dǎo)NF-κB的激活。以上結(jié)果

8、提示TLR4參與PRDX3誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。
　　3.PRDX3參與PRRSV誘導(dǎo)的NF-κB激活和炎癥因子的表達(dá)
　　首先，利用間接免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)PRRSV感染Marc-145細(xì)胞后，不能改變PRDX3的線粒體定位。隨后采用Western blot檢測發(fā)現(xiàn)PRRSV感染能誘導(dǎo)細(xì)胞上清中PRDX3的表達(dá)，而胞內(nèi)PRDX3則略微下調(diào)。由于PRRSV感染顯著激活了Exosome介導(dǎo)的蛋白分泌途徑和會引起細(xì)胞線粒體損傷，溶解，我們

9、推測Exosome在PRRSV誘導(dǎo)PRDX3的分泌中具有重要的作用。
　　隨后，我們檢測發(fā)現(xiàn)PRDX3不影響PRRSV的增殖。但將純化的PRDX3蛋白處理Marc-145細(xì)胞，通過Real-time PCR檢測發(fā)現(xiàn)胞外PRDX3能上調(diào)PRRSV誘導(dǎo)的IL-6、IL-8、TNF-α等炎癥因子的表達(dá)。將PRDX3干擾分子轉(zhuǎn)染Marc-145細(xì)胞后接種PRRSV，干擾內(nèi)源性的PRDX3促進(jìn)PRRSV誘導(dǎo)的IL-6、IL-8、TNF-α等