胚胎移植細(xì)胞工程

1、第六章 胚胎移植,,1,胚 胎 移 植,胚胎移植（embryo transfer,ET）也稱受精卵移植，是指將一頭良種母畜配種后的早期胚胎取出，或者由體外受精及其他方式獲得的胚胎，移植到另一頭同種的生理狀態(tài)相同的母畜體內(nèi)，繼續(xù)發(fā)育成為新個(gè)體，所以又稱之為人工授胎或借腹懷胎。,提供胚胎的個(gè)體稱為------供體（donor）接受胚胎的個(gè)體稱為------受體（recipient）,2,胚 胎 移 植 的 意 義,1.發(fā)揮優(yōu)良母

2、畜的繁殖潛力，提高繁殖效率。2.促進(jìn)家畜改良的速度3.產(chǎn)生雙胎和使不孕母畜獲得生殖能力4.瀕危動(dòng)物的拯救和保護(hù)5.研究手段,3,胚 胎 移 植 的 原 則,1.受體與供體在分類學(xué)上的相同屬性2.動(dòng)物生理上的一致性3.動(dòng)物解剖部位的一致性4.胚胎發(fā)育的期限5.胚胎的質(zhì)量6.供體、受體的狀況,4,,胚胎移植原則圖解,5,胚 胎 移 植 的 程 序,優(yōu)良種公畜,供體（優(yōu)良母畜）,超 數(shù) 排 卵 處 理,發(fā) 情、配

3、 種,胚 胎 回 收,超 數(shù) 排 卵 處 理,受體（優(yōu)良母畜）,同 期 發(fā) 情 處 理,發(fā) 情,胚 胎 移 植,優(yōu) 良 后 代,,,,,,,,,,,6,胚胎移植圖解,7,雄性生殖內(nèi)分泌調(diào)控,8,雌性生殖內(nèi)分泌調(diào)控1,9,雌性生殖內(nèi)分泌調(diào)控2,10,在生理或非妊娠條件下，雌性動(dòng)物每間隔一定時(shí)期均會(huì)出現(xiàn)一次發(fā)情，通常將這次發(fā)情開始至下次發(fā)情開始、或這次發(fā)情結(jié)束至下次發(fā)情結(jié)束所間隔的時(shí)期，稱為發(fā)情周期。,發(fā) 情 周 期,1

4、1,通常根據(jù)動(dòng)物的精神狀態(tài)、雌性動(dòng)物對(duì)雄性動(dòng)物產(chǎn)生的性欲表現(xiàn)、卵巢內(nèi)卵泡的生長發(fā)育、排卵和黃體形成的情況及雌性生殖道（子宮、陰道等）的生理變化等幾個(gè)主要方面，將發(fā)情周期劃分為：發(fā)情前期（前情期） 發(fā)情期 發(fā)情后期（后情期） 間情期（休情期）,12,13,1.供體的超數(shù)排卵( Superovulation of Donor ),在母畜發(fā)情周期的適當(dāng)時(shí)期，用促性腺激素進(jìn)行處理，誘發(fā)其卵巢上有大量卵泡同時(shí)發(fā)育并排卵，

5、稱為超數(shù)排卵，簡稱超排。超排技術(shù)通常用于單胎家畜，如牛、綿羊和山羊等，其目的是讓優(yōu)良母畜排出大量卵子，充分發(fā)揮其繁殖潛力，因而是胚胎移植中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，也是首要環(huán)節(jié)。超排方法：在發(fā)情周期的一定時(shí)期，用PMSG或FSH促進(jìn)卵泡發(fā)育，于發(fā)情開始后12-16h和20-24h各配種（輸精）一次，并于第一次配種后靜脈注射hCG或LH，以便排出多數(shù)卵子。,14,15,羊供體超排處理方案,16,羊的陰道栓處理,17,羊的陰道栓處理,18,19,

6、羊的陰道栓處理,20,影響超排效果的因素,家畜本身：母畜個(gè)體差異可導(dǎo)致超排反應(yīng)不同，這與家畜的種類、品種、年齡、體重及營養(yǎng)情況都有關(guān)系。促性腺激素：所用激素的種類、用量和注射程序，尤其是制品中兩種促性腺激素（FSH/LH )的比例差異，是影響胚胎數(shù)量及質(zhì)量的重要因素；用量的大小則與超排的多少直接有關(guān)，如果用量過大，往往會(huì)使卵泡發(fā)育過多，以致發(fā)生排卵延遲或不能排卵。,21,用藥時(shí)間：發(fā)情周期階段、產(chǎn)后階段及季節(jié)不同，超排

7、結(jié)果均有差別。 重復(fù)超排：一般而言，供體對(duì)前3次超排處理 的反應(yīng)相似，但有些個(gè)體對(duì)重復(fù)超排的反應(yīng)不佳，可能是由于促性腺激素產(chǎn)生了抗體。為了 提高重復(fù)超排的效果，一是延長激素處理的間 隔，二是盡量采用同種動(dòng)物的促性腺激素，以減少抗體的產(chǎn)生。,22,超排效果好的卵巢黃體,23,超排效果不好的卵巢黃體,24,2.受體的同期發(fā)情( Synchroestrus of recipient ),無論在何種家畜或任何品種，為了使胚胎移植獲得

8、成功，必須使受體母畜與供體的發(fā)情同期化，使二者的生殖器官處于相同的生理階段。受體與供體發(fā)情開始的時(shí)間越接近，移植的受胎率越高。這是因?yàn)槿焉锍跗诘淖訉m環(huán)境在不斷發(fā)生變化，而特定時(shí)間的環(huán)境只適合于發(fā)育階段相應(yīng)的胚胎生存；也可能是因?yàn)榉峭谂咛ゲ荒軐?duì)受體產(chǎn)生促黃體作用。為了獲得最佳受胎效果，應(yīng)將受體與供體的發(fā)情時(shí)間之差控制在24h之內(nèi)。,25,同期發(fā)情方法:誘發(fā)同期發(fā)情的理想藥物有孕激素和前列腺素PGF2α及其類似物。其劑量根據(jù)PG種類和用

9、法不同而異。在國外，普遍采用氯前列烯醇(cloprostenol)和15甲基PGF2α倘若在400頭以上的大牛群中進(jìn)行胚胎移植，因?yàn)槊刻於伎赡苡龅桨l(fā)情母牛，就可以盡量選留自然發(fā)情的母牛作為受體，不需要進(jìn)行同期發(fā)情處理。,26,羊受體的同期發(fā)情處理方案,27,3.供體的配種（輸精）,超排供體的配種次數(shù)，應(yīng)比自然供體多一些，每次輸入的精子數(shù)亦應(yīng)增多。超排供體的受精率，通常比自然供體為低，這可能是由于排卵不集中、卵母細(xì)胞有缺陷或母畜生

10、殖道的環(huán)境不太適宜于精子的運(yùn)行。,28,4.收集胚胎（Collection of eggs）,收集胚胎就是在配種或輸精后的適當(dāng)時(shí)間，從超排供體回收其胚胎，以備給受體移植，亦稱胚胎回收或胚胎采集，簡稱采卵。采卵的效果與采集時(shí)間、方法和檢卵技術(shù)均有關(guān)系。,29,（1）.采卵時(shí)間,一般將配種當(dāng)日定為0 天，由配種后第二天開始計(jì)算采卵天數(shù)。根據(jù)采集目的不同，決定在第幾天采卵。就母牛而言，一般第1-4天可以由輸卵管采到16細(xì)胞以前的卵，5－8天可

11、以由子宮采到桑植胚和囊胚。其依據(jù)是胚胎在生殖道內(nèi)的發(fā)育情況及移行速度 .,30,31,32,33,（2）．采卵方法,有手術(shù)法和非手術(shù)法兩種。在大家畜基本上已將手術(shù)法淘汰，但在綿羊、山羊、豬和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由于受解剖特點(diǎn)的限制，一直采用手術(shù)方法。不管用何種方法，一般收集卵子數(shù)只能相當(dāng)于黃體數(shù)的40～80％。,34,第一種由宮管結(jié)合部沖向輸卵管。本法沖卵率高，很少損害生殖道。除了豬因?qū)m管結(jié)合部具有閥門樣結(jié)構(gòu)不能采用以外，各種中、小動(dòng)物均可采用。

12、第二種方法是由輸卵管傘沖向?qū)m管結(jié)合部。本法適用于豬，是由一個(gè)插入該處的鈍注射針頭或光滑的細(xì)玻管收集卵子；其缺點(diǎn)是術(shù)后常造成宮角尖端或輸卵管粘連。,手術(shù)法采卵,35,第三種方法是由子宮角尖端沖向子宮角基部。本法用于發(fā)情5天以后收集子宮內(nèi)的卵，其收集數(shù)量比A, B法略少，易引起子宮粘連。 沖卵液為杜氏PBS,用量:第一、第二兩種方法用5-l0ml，第三種方法用10-20ml。,36,37,羊的手術(shù)法采卵,38,羊的手術(shù)法采卵,39

13、,手術(shù)操作現(xiàn)場,40,Sμgie創(chuàng)造了一種帶有氣球的非手術(shù)采卵器，可由牛的子宮角采卵，顯著提高了采卵率。Folley和Stewart又相繼改進(jìn)，設(shè)計(jì)出三通路（進(jìn)氣、進(jìn)液、回液）導(dǎo)管采卵器（附圖4），使用更加方便有效，能夠從同一供體反復(fù)收集卵子。沖卵液的用量一般為500 ml，裝入輸液瓶內(nèi)，每次放出30-60m1，反復(fù)沖洗子宮角，并回收到集卵杯內(nèi)。沖完一個(gè)子宮角后，再用同法沖洗另一子宮角。,非手術(shù)法采卵,41,42,43,5.檢卵（E

14、gg picking）,將沖卵液回收之后，盡快置于放大10-15倍的實(shí)體顯微鏡下，檢查收集到的卵數(shù)，并用一細(xì)吸管將卵移至新鮮培養(yǎng)液內(nèi)，在放大40-200倍的復(fù)式顯微鏡下，進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，選出適合于移植的正常卵（附圖5）。形態(tài)不正常者（附圖6）及發(fā)育延遲2天以上的卵，都不可用于移植。,44,檢胚,45,顯微鏡下的胚胎,46,47,48,6.移植胚胎（Egg transplantation）,移植胚胎就是將采取的可用卵移給受體母畜，亦稱卵的

15、移植，簡稱移卵。移卵方法：與采卵方法相似，也分為手術(shù)法與非手術(shù)法兩種，前者適用于不能進(jìn)行直腸操作的中小動(dòng)物，后者適用于大家畜。,49,手術(shù)法移卵,方法與采卵一樣，先暴露輸卵管及子宮角，再將卵注入輸卵管或子宮角。當(dāng)移入輸卵管時(shí)，將毛細(xì)移卵管的尖端通過輸卵管傘插到壺腹部，注入含有胚胎的培養(yǎng)液1～2滴；若移入子宮角，可先用鈍針頭刺破子宮角壁，然后將毛細(xì)管從針孔插入子宮腔，注入含胚胎的培養(yǎng)液,50,51,52,羊的手術(shù)法移卵,53,54,非手