彌散性血管內(nèi)凝血的實驗研究.pdf

1、本文研究目的：1．比較研究普通肝素、低分子肝素、抗凝血酶和重組水蛭素在家兔DIC模型中的抗凝療效；2．比較不同白血病細胞的纖溶活性及對白血病細胞表面尿激酶受體(uPAR)和膜結(jié)合蛋白II(annexinII)的分析，探討全反式維甲酸對APL細胞高纖溶狀態(tài)的影響。 方法： 1．不同抗凝劑對實驗動物DIC的治療作用(D建立DIC動物模型，脂多糖按2．5mg／kg由兔耳緣靜脈緩慢注入，分兩次給藥，間隔1h，每次脂多糖注射時間為

2、10min。(2)動物分組，將動物隨機分為5組，對照組、肝素組、低分子肝素組、抗凝血酶組和重組水蛭素組每組6只，分別于第一次注射脂多糖的同時在新西蘭大白兔對側(cè)耳緣靜脈分別注入生理鹽水、肝素鈉100IU／kg、低分子量肝素100U／kg、抗凝血酶100U／kg、重組水蛭素100IU／kg。在注射脂多糖前，注射后2h、4h、6h分別取血，檢測活化部分凝血活酶時間(APTT)、凝血酶時間(TT)、纖維蛋白原含量、血清纖維蛋白降解產(chǎn)物(FDP)

3、、抗凝血酶活性、血小板數(shù)、白細胞數(shù)及血紅蛋白含量，實驗結(jié)束后處死動物，取心臟、腎臟、脾臟、肺與肝組織經(jīng)甲醛固定，HE染色后在光鏡下觀察纖維蛋白血栓形成。 2．白血病細胞纖溶活性的體外研究(1)細胞培養(yǎng)，取指數(shù)生長期的NB4(急性早幼粒細胞白血病M3)、SHI．1(急性單核細胞白血病Ms)、K562(急性紅白血病M6)、Jurkat(急性T淋巴細胞白血病)和Raji(急性B淋巴細胞白血病)白血病細胞，以2×10S／mi接種于玻璃培

4、養(yǎng)瓶，NB4細胞、K562細胞、Jurkat細胞和Raji細胞加含15％小牛血清的RPMll640培養(yǎng)液，SHI-1細胞加含15％小牛血清的IMDM培養(yǎng)液培養(yǎng)。人臍靜脈內(nèi)皮細胞加含15％小牛血清的EMDM培養(yǎng)液培養(yǎng)。(2)纖溶酶活性測定取濃度為2×106傳代培養(yǎng)第3天的NB4、SHI．1、K562、Jurkat、Raji和人臍靜脈內(nèi)皮細胞，離心去上清后加入纖溶酶原150nmol／L，37~C溫育3h后離心留取上清，用發(fā)色底物法測上清液的

5、纖溶酶活性。(3)用流式細胞儀檢測白血病細胞尿激酶受體和膜結(jié)合蛋白II的蛋白表達。(4)KT-PCR半定量分析測定白血病細胞尿激酶受體和膜結(jié)合蛋白II的mRNA表達。 結(jié)果： 1．不同抗凝劑對實驗動物DIC的治療作用(1)大白兔注射脂多糖后2h、4h、6hAPTT均明顯延長，注射脂多糖后6h纖維蛋白原含量下降明顯P<0．01，抗凝血酶活性明顯下降，血小板計數(shù)呈進行性下降；病理檢查心臟、肝臟、腎臟、脾臟和肺組織均可見纖維蛋

6、白血栓形成。(2)肝素組、低分子肝素組、抗凝血酶組和重組水蛭素組APTT均明顯延長，低分子量肝素組、抗凝血酶組和重組水蛭素組動物于注射脂多糖后2h、4h、6h纖維蛋白原含量有逐漸下降趨勢，但無統(tǒng)計學差異；肝素組動物注射脂多糖后4h、6h纖維蛋白原含量有明顯下降；各抗凝治療組凝血因子X活性的下降受到不同程度的抑制；各治療組動物注射脂多糖后血小板也顯著下降，肝素治療組更明顯：家兔心臟、肝臟、腎臟、脾和肺組織光鏡下血管內(nèi)未見明顯血栓形成。

7、 2.　啟血病細胞纖溶活性的體外研究(1)與人臍靜脈內(nèi)皮細胞相比，NB4細胞和SHI．1細胞與纖溶酶原作用后上清液纖溶酶活性明顯升高，(P<0．01)。(2)ATRA處理后的NB4細胞纖溶活性明顯下降，ATRA對SHI．1、K562、Raji、Jurkat細胞的纖溶活性無影響。(3)SHI．1細胞uPAR陽性表達率為(99．00±0．26)％，NB4細胞uPAR陽性表達率為(13．15±L61)％，ATRA可明顯降低NB4細胞uPA

8、R的表達，對SHI．1和Jurkat細胞uPAR的表達無影響。(4)NB4細胞annexinII陽性表達率為(95．97±1．19)％，SHI-1細胞annexinII陽性表達率為(90．35±2．15)％，ATRA能下調(diào)NB4細胞annexinII的表達，(P<0．01)但對SHI．1、K562、Raii、Jurkat細胞annexinII的表達無影響。(5)NB4細胞、SHI-1細胞、K562細胞及Jurkat細胞中均檢測到uPAR

9、基因的表達，SHI-1細胞和NB4細胞uPARmRNA表達較高，ATRA作用后，NB4細胞uPARmRNA表達下調(diào)，(P＜0．05)：ATRA對SHI．1細胞、K562細胞及Jurkat細胞uPAR基因表達無影響。(6)annexinⅡmRNA在NB4細胞和SHI．1細胞呈高表達，Raji細胞中低表達，ATRA可明顯下調(diào)NB4細胞annexinIImRNA表達，ATRA對Raii細胞、K562細胞和Jurkat細胞annexinIImR

10、NA表達無影響。 結(jié)論： 1．凝血酶在DIC的發(fā)生中起著核心的作用。拮抗凝血酶的活性是DIC治療的重要措施，無論是凝血酶的直接抑制劑還是間接抑制劑，均能有效地抑制DIC的微循環(huán)血栓的形成。 2．在DIC的治療中，不同的凝血酶抑制劑的治療效果不完全相同，重組水蛭素和抗凝血酶優(yōu)于低分子肝素和肝素，低分子肝素的療效和肝素相似，但對血小板影響小。 3．不同白血病細胞使纖溶酶原轉(zhuǎn)化為纖溶酶的能力不同，其中SHI-l