楊樹D類周期蛋白基因PoptrCYCD1；1的RNAi與Poptr；CYCD3；3的過表達(dá)研究.pdf

1、植物D類周期蛋白控制細(xì)胞周期的進(jìn)程，在細(xì)胞的分裂過程中起重要作用。以楊樹CYCD1;1、 CYCD3;3周期蛋白基因作為研究對象，構(gòu)建植物抑制表達(dá)載體pCAMBIA1301-CYCD1;1-RNAi（以下簡稱p1301-D1;1-RNAi）轉(zhuǎn)化Poptr;CYCD1;1的過表達(dá)煙草、野生型楊樹，來研究Poptr;CYCD1;1的功能?？寺〔Ⅱ?yàn)證Poptr;CYCD3;3的啟動子特征，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花絮侵染法轉(zhuǎn)化擬南芥分析Poptr;C

2、YCD3;3基因表達(dá)的組織特異性。構(gòu)建融合熒光蛋白psGFP-Poptr; CYCD3;3，利用基因槍介導(dǎo)法導(dǎo)入洋蔥表皮細(xì)胞，對Poptr;CYCD3;3蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位研究。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化野生型煙草，來研究Poptr;CYCD3;3基因的過表達(dá)對煙草生長發(fā)育和細(xì)胞的分化的影響，結(jié)果表明:
　　1、用p1301-D1;1-RNAi載體轉(zhuǎn)化Poptr;CYCD1;1過表達(dá)煙草，得到20株轉(zhuǎn)基因株系，經(jīng)PCR、定量、半定

3、量、Northern檢測，表明Poptr;CYCD1;1的表達(dá)量明顯降低，過表達(dá)煙草又幾乎恢復(fù)野生型的性狀，說明該抑制表達(dá)載體是有效的，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　2、用抑制表達(dá)載體p1301-CYCD1;1-RNAi轉(zhuǎn)化野生型楊樹，得到8個轉(zhuǎn)基因株系，經(jīng)PCR、定量、半定量、Northern檢測，證明Poptr;CYCD1;1的表達(dá)量已經(jīng)下降，對生長50天的轉(zhuǎn)基因幼苗與WT楊樹的莖、葉做石蠟切片進(jìn)行組織學(xué)觀察，性狀差異不明顯，還有待進(jìn)

4、一步觀察研究。
　　3、Poptr;CYCD3;3基因開放讀碼框全長為1161bp，共編碼386個氨基酸，該基因編碼蛋白的分子量為97634.3，等電點(diǎn)為5.04，Poptr;CYCD3;3基因的同源性與蓖麻的最為接近。
　　4、融合蛋白CYCD3;3-GFP的綠色熒光信號集中在細(xì)胞核內(nèi)，而對照組GFP信號彌散在整個細(xì)胞內(nèi)，說明Poptr;CYCD3;3是一個細(xì)胞核定位的蛋白。
　　5、構(gòu)建植物表達(dá)載體pCAMBIA1

5、301-Promoter:CYCD3;3侵染擬南芥，篩選檢測后，將萌發(fā)7天的擬南芥進(jìn)行GUS染色分析，結(jié)果表明:Poptr;CYCD3;3基因的表達(dá)模式主要集中在生長點(diǎn)表達(dá)。
　　6、構(gòu)建植物表達(dá)載體pROKⅡ-Poptr;CYCD3;3，經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化煙草，通過卡那霉素的篩選獲得20株轉(zhuǎn)基因株系，對其進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果表明基因能夠在煙草植株中表達(dá)。但從組培苗到生根苗與同期野生型煙草對照，性狀不明顯，有待觀察研究。