DRR1基因的表達(dá)與功能初探以及靶向PLK1基因RNAi的抗腫瘤作用.pdf

1、非洲爪蟾(Xenopus laevis)模型系統(tǒng)是一種重要的新基因功能研究平臺(tái)。本研究利用RT-PCR的方法從非洲爪蟾卵母細(xì)胞總RNA中克隆得到了與人DRR1基因(hDRR1)同源的cDNA片斷，生物信息學(xué)分析結(jié)果表明該基因編碼的蛋白與人和小鼠的同源蛋白具有高度的序列相似性，同源性分別為74％和66％，因此將爪蟾的這個(gè)基因定名為xDRR1(Xenopus DRR1)。將xDRR1基因克隆于真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-N1以及pcDNA3.1

2、(+)，構(gòu)建了表達(dá)載體pEGFP-N1/xDRR1和pcDNA3.1(+)/xDRR1。通過(guò)表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)，xDRR1基因在爪蟾胚胎早期發(fā)育的不同階段以及成體的各個(gè)組織中均有廣泛表達(dá)。將表達(dá)載體pEGFP-N1/xDRR1轉(zhuǎn)染人非小細(xì)胞肺腺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞，亞細(xì)胞定位顯示xDRR1基因編碼一種核蛋白。xDRR1作為一種含有螺旋卷曲結(jié)構(gòu)的核蛋白，提示它可能通過(guò)與其它蛋白或DNA的相互作用來(lái)參與基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。用表達(dá)載體pcD

3、NA3.1(+)/xDRR1轉(zhuǎn)染A549肺癌細(xì)胞，表明xDRR1對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)具有抑制作用。然而，應(yīng)用反義技術(shù)抑制xDRR1基因的表達(dá)或顯微注射相應(yīng)的xDRR1 mRNA后并未觀察到明顯的發(fā)育異常表型。 人的DRR1基因廣泛表達(dá)于正常的組織中，但在體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞或者原發(fā)性腫瘤中期表達(dá)通常被下調(diào)。通過(guò)原核表達(dá)載體pQE30在大腸桿菌中對(duì)DRR1進(jìn)行了表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)融合有6個(gè)組氨酸(6xHis)的重組蛋白的可溶性具有溫度依賴性的。在

4、37℃誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)，重組DRR1蛋白(rDRR1)以可溶性和非可溶性兩種形式存在，其中可溶性蛋白占到重組蛋白的80％左右；當(dāng)在20℃誘導(dǎo)時(shí)，rDRR1蛋白幾乎完全以可溶性的形式表達(dá)。通過(guò)Ni-NTA樹(shù)脂對(duì)20℃誘導(dǎo)表達(dá)的rDRR1蛋白在非變性條件下進(jìn)行了純化，并對(duì)純化所得到的蛋白進(jìn)行了電噴霧電離質(zhì)譜(ESI-MS)鑒定。rDRR1蛋白進(jìn)一步被用來(lái)制備多克隆抗體，該抗體能夠識(shí)別外源性表達(dá)的DRR1蛋白以及培養(yǎng)細(xì)胞或者組織中的內(nèi)源性DRR1蛋