靶向DC的雙功能融合分子的抗腫瘤作用研究.pdf

1、樹突狀細胞(DC)作為功能最強大的抗原呈遞細胞(APC),最大的特點是能夠刺激初始(naive)T細胞增殖和啟動機體免疫反應,在誘導特異性抗腫瘤細胞免疫中起關鍵作用。由于DC具有強烈的免疫激活作用,它的抗腫瘤功能成為近年來備受矚目的熱點。前期實驗研究表明,以適當形式的腫瘤抗原加載的DC疫苗都能夠激活抗原特異性T細胞識別、殺傷腫瘤細胞,從而產(chǎn)生特異性的抗腫瘤反應。但是進行DC的體外擴增及誘導成熟,操作復雜,重復性差,大大限制了它的應用。

2、 將特異性腫瘤抗原與單克隆抗體制備為融合蛋白,人為干預體內(nèi)DC功能調(diào)節(jié),以增強其T細胞活化功能是增強DC誘導特異性免疫應答的新方式,它利用單抗與DC的特異性結合而將腫瘤抗原定向給予(targeting delivery)到DC,使其被內(nèi)吞,經(jīng)加工處理后提呈于細胞表面,激活T細胞。但前期研究結果顯示,這種融合蛋白非但沒能誘導產(chǎn)生特異性免疫反應,反而在正常免疫力小鼠中誘導出免疫耐受,推測可能原因是非成熟DC(iDC)不能被激活形成成熟

3、DC(mDC),因而在外周誘導抗原特異性T細胞的清除和無能(anergy)。 本研究在前期實驗基礎上,設計構建了新型DC靶向腫瘤疫苗FL-Fc-αCD11c-TRP2180-188。FL是一種能夠刺激早期造血的細胞因子,不僅能使骨髓增加生產(chǎn)DC的數(shù)量,而且可使DC的功能趨向成熟,使后者具有更強的抗原遞呈和抗腫瘤作用。因此,可將FL作為刺激信號聯(lián)合CD11c抗體(αCD11c)將黑色素瘤相關抗原肽TRP2180-188定向給予DC

4、。CD11c作為小鼠DC表面特異性標志,抗CD11c抗體具有特異靶向DC的作用,是體內(nèi)DC修飾的理想載體。 本研究主要探討該融合蛋白的免疫作用途徑及其對同系小鼠的抗腫瘤作用,包括以下幾個方面： 一、融合基因的克隆及表達載體的構建 利用基因工程技術,構建FL-Fc-αCD11c-TRP2180-188融合蛋白的表達載體。首先用5'RACE技術獲得倉鼠抗小鼠CD11c抗體(N418)輕、重鏈可變區(qū)序列,VH和VL經(jīng)o

5、verlap PCR的方法獲得單鏈抗體,并在3'末端通過(Gly4Ser)3連接TRP2180-188。FL-Fc融合基因已由本所構建,經(jīng)overlap PCR通過(Gly4Ser)3在3'末端連接αCD11c-TRP2180-188,得到大小為2190bp的FL-Fc-αCD11c-TRP2180-188的融合基因。將融合基因通過兩端的酶切位點裝入線性化的表達載體pcDNA3.1(+),經(jīng)酶切測序鑒定,成功構建融合基因的真核表達載體。

6、 二、融合蛋白的表達、純化與體外靶向功能檢測 通過脂質(zhì)體法將FL-Fc-αCD11c-TRP2180-188/pcDNA3.1(+)融合質(zhì)粒轉染CHO細胞,72h后在上清中可檢測到目的蛋白。通過篩選劑、Dot-Blot篩選出高表達克隆,經(jīng)擴增及適應性無血清培養(yǎng)后,收集培養(yǎng)上清,Protein A親和層析柱純化得到FL-Fc-αCD11c-TRP2180-188融合蛋白,SDS-PAGE和Westem-Blot顯示融合蛋白

7、為三聚體,單體大小80KDa。在體外擴增培養(yǎng)小鼠骨髓DC,在收獲的細胞中,CD11c+細胞占90％,FACS結果顯示融合蛋白能特異性結合DC細胞。 三、融合蛋白的免疫增強作用 用FL-Fc-αCD11c-TRP2180-188融合蛋白致敏C57BL/6小鼠,在免疫后8h分離出淋巴結單個核細胞,其中CD11c+FL+、CD11c+CD86+細胞數(shù)量明顯高于無關抗體對照組,表明FL-Fc-αCD11c-TRP2180-188

8、融合蛋白在體內(nèi)可通過CD11c抗體靶向連接于DC,并可誘導DC的體外成熟。在免疫后7d分離出的淋巴結單個核細胞,經(jīng)負載抗原的DC刺激后可發(fā)生特異性T細胞的增殖,同時分泌IFNγ、TNFα等Th1型細胞因子,收獲的CTL對表達TRP2的小鼠黑色素瘤細胞B16/F1有抗原特異性殺傷作用。結果表明FL-Fc-αCD11c-TRP2180-188融合蛋白能夠特異性的增強機體免疫作用。 四、融合蛋白對同系小鼠的預防和治療作用 B1

9、6/F1是表達TRP2抗原的小鼠黑色素瘤細胞株,將1×104個B16/F1細胞背部皮下接種C57BL/6小鼠,隨機分3組,在接種后一周分別于皮下注射100μg FL-Fc-αCD11c-TRP2180-188、FL-Fc與αCD11c-TRP2180-1881混合蛋白或等體積PBS,觀察50天,并測量腫瘤大小。結果顯示,FL-Fc-αCD11c-TRP2180-188組腫瘤生長明顯受到抑制。各組小鼠經(jīng)間隔一周的兩次免疫后,接種1×104

10、個B16/F1,觀察50天,并測量腫瘤大小。結果顯示,FL-Fc-αCD11c-TRP2180-188組成瘤率明顯降低,腫瘤大小比對照組小。將未長腫瘤的小鼠處死,分離單個核細胞,與B16/F1細胞作用,發(fā)現(xiàn)有對B16/F1腫瘤細胞的特異性殺傷作用。 綜上所述,FL-Fc-αCD11c-TRP2180-188融合蛋白能通過CD11c抗體與細胞表面CD11c特異性的結合而將腫瘤抗原肽TRP2定向給予到DC,FL則能夠促進DC的成熟,