RTA系列融合蛋白的表達(dá)及其抗腫瘤功能研究.pdf

1、Viral protein22(VP22)是Ⅰ型單純皰疹病毒的殼皮蛋白，作為一種細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)肽(Cell-Penetrating Peptides，CPPs)，能介導(dǎo)其融合蛋白進(jìn)入細(xì)胞并具有細(xì)胞間穿梭功能。TAT是來(lái)自HIV的含11個(gè)氨基酸的短肽，也是一種轉(zhuǎn)導(dǎo)肽，被廣泛用于轉(zhuǎn)導(dǎo)肽段、寡核苷酸和蛋白進(jìn)入細(xì)胞。促性腺激素釋放激素(gonadotrophin releasing hormone，GnRH)是下丘腦分泌的含有十個(gè)氨基酸的短肽類激素，

2、它可以作用于垂體前葉促進(jìn)促性腺激素的分泌。文獻(xiàn)報(bào)道在乳腺多種腫瘤細(xì)胞表面都有GnRH受體分布，這為GnRH作為大分子藥物載體提供了科學(xué)依據(jù)。氧依賴性降解區(qū)域(oxygen-dependent degradation domain，ODD)可以控制缺氧誘導(dǎo)因子-1a(HIF-1a)存在與否，在常氧條件下會(huì)通過(guò)羥化特定位點(diǎn)的脯氨酸，進(jìn)而使HIF-1a被蛋白酶降解。缺氧是實(shí)體腫瘤的特征性病理改變，含有ODD的融合蛋白可以穩(wěn)定存在。蓖麻毒素A鏈

3、(Ricin Toxin A Chain，RTA)是蓖麻毒素的效應(yīng)鏈，它是一種RNA特異性的N-糖苷酶，可催化核糖體60s亞基中28S rRNA的一個(gè)高度保守的環(huán)狀結(jié)構(gòu)脫去一個(gè)特殊的腺嘌呤(在大鼠中為A-4324位)，從而使蛋白合成功能受阻，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。
　　 本課題目的是以RTA作為抑制腫瘤細(xì)胞增殖的活性分子，利用GnRH、TAT以及VP22的作用將融合蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，并利用ODD的降解作用減輕RTA對(duì)正常細(xì)胞的毒性，

4、提高融合蛋白對(duì)實(shí)體瘤的靶向性作用。構(gòu)建pET28a-RTA、pET28a-VP22-RTA、pET28a-GnRH-RTA、pET28a-TAT-RTA及pET28a-VP22-ODD-RTA原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，誘導(dǎo)RTA融合蛋白的可溶性表達(dá)，超聲裂解表達(dá)后菌體，利用融合蛋白上的組氨酸標(biāo)簽進(jìn)行親和層析純化目的蛋白，在分子、腫瘤細(xì)胞和動(dòng)物整體水平研究融合蛋白的腫瘤抑制活性。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：應(yīng)用無(wú)細(xì)胞系蛋白合成抑制

5、實(shí)驗(yàn)測(cè)定融合蛋白對(duì)蛋白合成的抑制作用；SRB法測(cè)定融合蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用；細(xì)胞免疫熒光法、細(xì)胞免疫化學(xué)法測(cè)定融合蛋白是否可以進(jìn)入腫瘤細(xì)胞以及融合蛋白在細(xì)胞中的定位；應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定融合蛋白誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。以人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞建立Bal b/c裸鼠荷瘤模型，將建模成功的荷瘤鼠分為四組，即TC(腫瘤對(duì)照組)組，RTA組，GnRH-RTA組和TAT-RTA組，用腹腔給藥的方式(實(shí)驗(yàn)組融合蛋白3 mg/kg/天，對(duì)照組生理

6、鹽水200μL/只/天)測(cè)定融合蛋白在體內(nèi)抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用，同時(shí)對(duì)荷瘤小鼠的血漿生化指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定初步判斷融合蛋白對(duì)動(dòng)物的毒副作用。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：①構(gòu)建了pET28a-RTA系列原核表達(dá)載體，并利用該系列載體表達(dá)出可溶性的融合蛋白。②利用融合蛋白N端的His-tag，采用親和層析的方法進(jìn)行了RTA融合蛋白的純化。③經(jīng)細(xì)胞免疫熒光、細(xì)胞免疫化學(xué)分析表明融合蛋白GnRH-RTA，TAT-RTA可以進(jìn)入A549細(xì)胞、MDA-MB-

7、231細(xì)胞和H1299細(xì)胞。④經(jīng)無(wú)細(xì)胞系蛋白合成抑制實(shí)驗(yàn)測(cè)定表明，融合蛋白R(shí)TA、GnRH-RTA、TAT-RTA、VP22-RTA和VP22-ODD-RTA均具有明顯的蛋白合成抑制活性，抑制活性由高到低依次是：VP22-ODD-RTA、VP22-RTA、RTA、TAT-RTA、GnRH-RTA。⑤經(jīng)SRB法測(cè)定表明GnRH-RTA、TAT-RTA、VP22-RTA和VP22-ODD-RTA在常氧和缺氧條件下都能夠有效地抑制A549細(xì)胞

8、的增殖，并且抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的作用隨著蛋白濃度的增加而呈增強(qiáng)的趨勢(shì)；其中TAT-RTA較其他RTA融合蛋白的抑制作用更強(qiáng)，VP22-ODD-RTA在常氧和缺氧條件下對(duì)A549的生長(zhǎng)抑制作用沒(méi)有明顯的差別。SRB法還測(cè)定了融合蛋白對(duì)HepG2細(xì)胞、Hela細(xì)胞、MDA-MB-231細(xì)胞以及H1299細(xì)胞的增殖抑制作用。對(duì)HepG2細(xì)胞和Hela細(xì)胞：融合蛋白在常氧條件下對(duì)細(xì)胞均有增殖抑制作用，且成劑量依賴性，在缺氧條件下也都有增殖抑制作用，但

9、無(wú)劑量依賴性；對(duì)H1299和MDA-MB-231細(xì)胞：融合蛋白在常氧和缺氧狀態(tài)下均有生長(zhǎng)抑制作用，在蛋白濃度大于10-7M時(shí)抑制作用較明顯，其中TAT-RTA的作用比其他融合蛋白顯著。同樣，SRB實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明VP22-ODD-RTA對(duì)HepG2、Hela、MDA-MB-231以及H1299細(xì)胞的作用在常氧和缺氧條件下無(wú)明顯差別。⑥流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，在常氧狀態(tài)下RTA系列融合蛋白可以隨時(shí)間延長(zhǎng)增加A549細(xì)胞早期凋亡的百分率，其作用在4

10、8 h最強(qiáng)，與培養(yǎng)基對(duì)照相比，TAT-RTA在給藥48 h時(shí)可顯著誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生早期凋亡。⑦測(cè)量、計(jì)算各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物瘤體體積發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較RTA、GnRH-RTA、TAT-RTA顯示了較好的抑制瘤體生長(zhǎng)的趨勢(shì)，但是給藥期間各組的動(dòng)物體重分析表明RTA和TAT-RTA對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的毒性較大，導(dǎo)致動(dòng)物體重明顯下降。⑨動(dòng)物血漿生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果表明，融合蛋白對(duì)動(dòng)物的肝、腎功能都有不同程度的影響，以RTA和TAT-RTA最為明顯。