抗EGFR單鏈抗體與力達霉素融合蛋白的構(gòu)建及其抗腫瘤活性研究.pdf

1、北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院博士學(xué)位論文抗EGFR單鏈抗體與力達霉素融合蛋白的構(gòu)建及其抗腫瘤活性研究姓名：盛唯瑾申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：微生物與生化藥學(xué)指導(dǎo)教師：甄永蘇李電東20090601北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院博士學(xué)位論文中文摘要2抗EGFR單鏈抗體與力達霉素輔基蛋白融合蛋白ER(FvLDP)的構(gòu)建及活性分析利用基因重組技術(shù)將篩選出來的EGFR高親和力單鏈抗體片段基因連接到含有力達霉素輔基蛋白基因的重組質(zhì)粒pET30(a)LDP，構(gòu)建重組質(zhì)粒

2、pET30(a)scFvLDP，轉(zhuǎn)化到EcoliBL21(DE3)staroM中，IPTG誘導(dǎo)帶有組氨酸標簽肽(Histag)的融合蛋白的表達。融合蛋白分子量約為38kDa，主要以包涵體形式存在。Ni離子親和柱純化融合蛋白，蛋白收獲量約為5mg／L。ELISA檢測及細胞免疫熒光顯示融合蛋白與純EGFR抗原的相對親和力為80x10一M，對EGFR高表達的腫瘤細胞的親和力明顯高于低表達的正常細胞。流式細胞儀檢測結(jié)果表明融合蛋白可引起細胞周期

3、的G2／M期阻滯，且這種抑制作用存在著一定的劑量依賴關(guān)系。細胞增殖實驗證明融合蛋白可抑制腫瘤細胞的增殖，其對EGFR高表達的A431和A549細胞的殺傷作用明顯強于EGFR低表達的HEK293細胞。體內(nèi)抑瘤實驗表明融合蛋白能夠顯著抑制人鱗狀上皮癌A431裸鼠移植瘤的生長，且毒副作用較小。融合蛋白05mg&g和5mg&g2個劑量組35天的抑瘤率分別為514％署t1675％，與對照組和LDP組相比有顯著差異。3抗EGFR單鏈抗體與力達霉素強

4、化融合蛋白ER(FvLDPAE)的制備及活性分析將抗EGFR單鏈抗體與力達霉素輔基蛋白的融合蛋白與力達霉素活性發(fā)色團組裝，得到強化融合蛋白。流式細胞儀檢測結(jié)果表明強化融合蛋白可引起細胞周期的G2／M期阻滯，且這種抑制作用存在著一定的劑量依賴關(guān)系。Hoechst染色顯示強化融合蛋白可以誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡。細胞增殖實驗證明強化融合蛋白對腫瘤細胞具有強殺傷作用，且強化融合蛋白作用要明顯強于單純的LDM，其作用于EGFR高表達的A43l和A54

5、9細胞的Ic50值分別是LDM的1／7和1／10。體內(nèi)抑瘤實驗表明強化融合蛋白對人鱗狀上皮癌A431裸鼠移植瘤具有明顯的抑制作用，且毒副作用較LDM小。強化融合蛋白02mg／kg和03mg／kg2個劑量組30天抑瘤率分別為754％和813％，與LDM組相比存在顯著差異。強化融合蛋白可以引起細胞周期G2／M阻滯，對EGFR高表達的腫瘤細胞有較強的體外殺傷活性，對人鱗狀上皮癌A431裸鼠移植瘤有顯著的抑制作用，有望成為一種具有良好應(yīng)用前景的