抗HER2單鏈抗體-精氨酸九聚體融合蛋白的表達(dá)及活性研究.pdf

1、骨骼是乳腺癌最常見的轉(zhuǎn)移部位，骨轉(zhuǎn)移約占乳腺癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的65％～75％。一旦乳腺癌轉(zhuǎn)移到骨，通常被認(rèn)為是不可治愈的，同時(shí)能夠?qū)е麓罅抗趋老嚓P(guān)事件包括慢性骨痛、病理性骨折、脊髓壓迫和高鈣血癥等嚴(yán)重并發(fā)癥，嚴(yán)重影響了癌癥患者的生存時(shí)間及生活質(zhì)量。目前在臨床上較為常用的治療乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的方法，如外科手術(shù)治療、放射治療、抗腫瘤藥物治療、鎮(zhèn)痛藥物治療以及激素治療等，均難以取得令人滿意的效果。
　　近年來，由于腫瘤靶向治療的特異性抗腫瘤作用，

2、治療毒副作用明顯減少，使腫瘤的靶向治療技術(shù)得以推廣，療效也不斷得到提高，開創(chuàng)了腫瘤治療的新前景。將靶向治療技術(shù)應(yīng)用于乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的治療，可以顯著提高腫瘤治療效果，同時(shí)為其他HER2陽(yáng)性腫瘤的基因治療提供新的候選分子。
　　由于發(fā)現(xiàn)RNA干擾(RNAi)可以特異性降低內(nèi)源性蛋白的表達(dá)，研究者希望利用RNAi治療許多遺傳性疾病和腫瘤等難治性疾病。小干擾RNA(siRNA)是RNAi發(fā)揮效應(yīng)所必需的因子，具有廣闊的治療應(yīng)用前景，但由于體

3、內(nèi)siRNA細(xì)胞內(nèi)吸收差、血漿內(nèi)穩(wěn)定性弱和非特異性轉(zhuǎn)運(yùn)，體內(nèi)遞送siRNA仍然是RNAi廣泛應(yīng)用于臨床治療的最大障礙。
　　單鏈抗體(scFv)由于保留了抗原結(jié)合活性同時(shí)分子量更小，免疫原性更低，是具有靶向性的優(yōu)良藥物遞送載體。scFv可與其他效應(yīng)分子融合構(gòu)成具有多重功能的分子，例如魚精蛋白、免疫毒素等。精氨酸九聚體(9R)是含有大量正電荷的堿性氨基酸，是一種細(xì)胞滲透性多肽，能依賴正負(fù)電荷相互作用而結(jié)合帶有負(fù)電荷的核酸物質(zhì)。

4、>　　近年來，研究發(fā)現(xiàn)CXCL12/CXCR4生物學(xué)軸在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移中起著重要作用。在多數(shù)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移組織中HER2和CXCR4的表達(dá)呈正相關(guān)，且CXCR4的高水平表達(dá)往往預(yù)示著癌癥患者的預(yù)后不良，這些使HER2與CXCR4成為腫瘤靶向治療中的重要靶點(diǎn)。在上述研究基礎(chǔ)上，本課題利用基因工程和蛋白質(zhì)技術(shù)，嘗試獲得人源性抗HER2單鏈抗體(scFv)/精氨酸九聚體(9R)融合蛋白scFv-9R，以期得到siRNA體內(nèi)遞送的良好載體，使針對(duì)C

5、XCR4的特異性siRNA可以在scFv-9R引導(dǎo)下，到達(dá)并內(nèi)化入HER2陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞，靶向抑制CXCR4表達(dá)，這種策略有望為臨床治療乳腺癌骨轉(zhuǎn)移提供一種新方法。
　　目的：
　　構(gòu)建人源性抗HER2單鏈抗體(scFv)/精氨酸九聚體(9R)融合蛋白基因，在大腸桿菌里表達(dá)純化并檢測(cè)該融合蛋白的活性。
　　方法：
　　采用PCR方法，擴(kuò)增融合基因scFv-9R，將獲得的基因克隆入原核表達(dá)載體pQE30，在大腸桿菌M

6、15中表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE和Western blot鑒定，通過Ni-NTA螯合層析純化，透析復(fù)性，超濾濃縮。ELISA實(shí)驗(yàn)分析scFv-9R抗原結(jié)合活性，間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀察scFv-9R抗原結(jié)合及內(nèi)化能力，凝膠遷移阻滯實(shí)驗(yàn)檢測(cè)融合蛋白siRNA結(jié)合活性，siRNA結(jié)合實(shí)驗(yàn)計(jì)算scFv-9R與siRNA結(jié)合比率。
　　結(jié)果：
　　成功構(gòu)建了人源性抗HER2scFv-9R融合基因，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后在M15中以包涵體

7、形式表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE和Western blot鑒定為目的蛋白。Ni柱親和層析獲得純度約為87％的目的蛋白。ELISA實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證scFv-9R具有抗原親和活性，間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)證明融合蛋白可以結(jié)合并內(nèi)化入HER2陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞，凝膠遷移阻滯實(shí)驗(yàn)證明scFv-9R具有siRNA結(jié)合活性,siRNA結(jié)合實(shí)驗(yàn)表明1分子融合蛋白大約可結(jié)合3分子siRNA。
　　結(jié)論：
　　scFv-9R具有結(jié)合HER2抗原并內(nèi)化入HER2陽(yáng)性腫