抗LMP1單鏈抗體-魚精蛋白截短體融合蛋白的基因構(gòu)建、表達(dá)及生物活性研究.pdf

1、[目的] 體外拼裝抗?jié)摲さ鞍?(Latent membrane protein-1，LMP1)單鏈抗體(singlechain variable fragment，scFv)/魚精蛋白截短體(truncated protamine，tP)融合蛋白基因(anti-LMP1 scFv/tP)，在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)、純化和復(fù)性anti-LMP1 scFv/tP融合蛋白，并對復(fù)性產(chǎn)物的抗原結(jié)合活性和DNA結(jié)合活性進(jìn)行研究。 [

2、方法] 在抗LMP1單鏈抗體基因的3’末端連接上編碼魚精蛋白截短體的基因序列，設(shè)計(jì)抗LMP1單鏈抗體/魚精蛋白截短體融合蛋白基因。根據(jù)表達(dá)載體pET-32a(+)的限制性酶切位點(diǎn)，在融合蛋白基因的5’和3’末端設(shè)計(jì)EcoRⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)。在DNAWORKS程序指導(dǎo)下將融合基因設(shè)計(jì)成22條相互互補(bǔ)的寡核苷酸序列，采用PCR為基礎(chǔ)的基因拼接獲得抗LMP1單鏈抗體/魚精蛋白截短體融合蛋白基因。將融合蛋白基因亞克隆至pMD18-

3、T simple克隆載體中，經(jīng)過酶切鑒定和測序驗(yàn)證；進(jìn)一步將序列完全正確的融合蛋白基因克隆至原核表達(dá)載體pET-32a(+)。在大腸桿菌Rosseta中誘導(dǎo)表達(dá)抗LMP1單鏈抗體/魚精蛋白截短體融合蛋白，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE和western blot驗(yàn)證。以包涵體形式表達(dá)的融合蛋白在變性條件下進(jìn)行純化，然后通過尿素濃度梯度透析復(fù)性的方法進(jìn)行復(fù)性。間接免疫熒光染色檢測復(fù)性融合蛋白與相應(yīng)抗原LMP1的結(jié)合活性，DNA凝膠遷移阻滯實(shí)驗(yàn)檢

4、測復(fù)性融合蛋白與DNA的結(jié)合活性。 [結(jié)果] 各寡核苷酸片段經(jīng)過兩輪PCR擴(kuò)增后可見明顯的產(chǎn)物帶，產(chǎn)物T-A克隆后，經(jīng)酶切和測序鑒定，獲得序列完全正確的抗LMP1單鏈抗體/魚精蛋白截短體融合蛋白基因，成功構(gòu)建了抗LMP1單鏈抗體/魚精蛋白截短體融合蛋白原核表達(dá)載體。轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosseta，用IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)，SDS-PAGE和western blot證實(shí)融合蛋白成功表達(dá)。變性融合蛋白通過Ni2+親合層析介質(zhì)得到有效純

5、化，尿素濃度梯度透析成功復(fù)性了融合蛋白。間接免疫熒光染色結(jié)果表明復(fù)性的融合蛋白具有抗原結(jié)合活性，能與LMP1表達(dá)陽性的CNEl-GL細(xì)胞結(jié)合，而不能與LMP1表達(dá)陰性的CNE1細(xì)胞結(jié)合；DNA凝膠遷移阻滯試驗(yàn)結(jié)果提示復(fù)性的融合蛋白具有DNA結(jié)合活性。 [結(jié)論] 在DNAWORKS程序指導(dǎo)下設(shè)計(jì)寡核苷酸序列并進(jìn)行體外基因拼裝是獲得目的基因的有效方法；抗LMP1單鏈抗體/魚精蛋白截短體融合蛋白基因在大腸桿菌Rosseta中誘