抗AFP重鏈可變區(qū)單域抗體融合蛋白的構(gòu)建、表達及初步鑒定.pdf

1、[目的]: 構(gòu)建抗甲胎蛋白(AFP)重鏈可變區(qū)(VH)單域抗體融合蛋白基因，并在大腸桿菌中表達，分離并初步純化抗AFP TrxA-V<,H>單域抗體融合蛋白，并鑒定其生物學活性。 [方法]: 采用已構(gòu)建的抗AFP單鏈抗體(ScFv)的載體為模板,經(jīng)PCR擴增出抗AFP V<,H>單域抗體基因，將其克隆到pGEM-T載體，構(gòu)建重組pGEM-V<,H>載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α并鑒定。用限制性內(nèi)切酶同時雙酶切重組p

2、GEM-V<,H>載體和大腸桿菌TrxA融合蛋白表達載體pET32a(+)，將從pGEM-V<,H>載體上酶切獲得的VH基因連接到pET32a(+)質(zhì)粒中，構(gòu)建重組pET32a-V<,H>質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL-21(DE3)。通過限制性內(nèi)切酶酶切、PCR和測序鑒定，將鑒定正確的陽性克隆通過IPTG誘導表達，SDS-PAGE及Western-blot鑒定表達產(chǎn)物。將陽性克隆大量發(fā)酵培養(yǎng)，溶解細菌，分離純化包涵體，用高濃度尿素將包涵體變性

3、溶解，再通過梯度濃度透析復性，獲得較高純度的TrxA-V<,H>單域抗體融合蛋白。通過與其親本單克隆抗體進行競爭抑制ELISA來分析TrxA-V<,H>融合蛋白的抗原結(jié)合活性；肝癌細胞株HepG2細胞免疫組化染色分析其結(jié)合及內(nèi)化情況；取原發(fā)性肝癌病理切片做免疫組化，并做正常肝組織對照。 [結(jié)果]: (1)成功克隆出抗AFP V<,H>單域抗體基因，酶切、PCR及測序鑒定證實，V<,H>單域抗體基因全長339bp，正確克隆

4、至pGEM-T載體。將正確構(gòu)建的重組pET32a-V<,H>質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL-21(DE3)，經(jīng)過IPTG誘導后獲得高效表達。目的蛋白以包涵體形式存在，經(jīng)反復洗滌、變性及復性后，可獲得獲得較高純度的抗AFP的TrxA-V<,H>單域抗體融合蛋白。SDS-PAGE及Western-blot證實在相應分子質(zhì)量處，有TrxA-V<,H>融合蛋白的特異性顯色條帶，其分子量約為33KD。 (2)競爭抑制ELISA結(jié)果顯示該融合蛋白具

5、有良好的抗原結(jié)合能力。 (3)肝癌細胞株HepG2免疫組化結(jié)果顯示該融合蛋白與天然AFP具有良好的結(jié)合能力及內(nèi)化能力。原發(fā)性肝癌病理切片免疫組化結(jié)果顯示該融合蛋白可用于原發(fā)性肝癌的病理輔助診斷中。 [結(jié)論]: 目前AFP是原發(fā)性肝癌診斷和生物治療的一種重要的靶抗原。我們構(gòu)建的抗AFP TrxA-V<,H>單域抗體融合蛋白分子量小，經(jīng)過競爭抑制ELISA、免疫細胞化學及原發(fā)性肝癌病理組織免疫組化證實具有良好的抗原結(jié)