新型抗HER2單克隆抗體的抗腫瘤作用及機(jī)制研究.pdf

1、人表皮生長(zhǎng)因子受體2（Human Epidermal growth factor Receptor2，HER2，也稱為ErbB2）是受體酪氨酸激酶的ErbB受體家族成員。約20％-30％乳腺癌患者的癌組織中有HER2基因的過度表達(dá)，HER2過表達(dá)的乳腺癌浸潤(rùn)性強(qiáng)，無病生存期短，預(yù)后差。HER2是具有酪氨酸激酶活性的跨膜蛋白，它沒有天然配體，在單體狀態(tài)下無活性，當(dāng)與ErbB家族其他3個(gè)成員EGFR、HER3、HER4形成異源二聚體時(shí)可使酪

2、氨酸激酶活化，激活MAPK和PI3K/Akt通路，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖。近年來以HER2為靶點(diǎn)的靶向治療已成為乳腺癌治療研究的熱點(diǎn)。Trastuzumab(Herceptin，曲妥珠單抗，赫賽汀)是由美國(guó)Genentech公司開發(fā)的靶向HER2的人源化單克隆抗體，它于1998年獲得美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于HER2高表達(dá)轉(zhuǎn)移性乳腺癌的治療。HER2分子的膜外區(qū)包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四個(gè)結(jié)構(gòu)域，Trastuzumab與HER2分子的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域Ⅳ結(jié)合

3、，可阻斷配體非依賴的HER2∶HER3異源二聚體的形成，但不能阻斷配體依賴的HER2∶HER3異源二聚體形成。即使在HER2高表達(dá)乳腺癌，Trastuzumab的有效率也僅為30％。Pertuzumab(Omnitarg，帕妥珠單抗)是美國(guó)Genentech公司研制的另一株的抗HER2人源化抗體。Pertuzumab可通過結(jié)合HER2分子膜外區(qū)的結(jié)構(gòu)域Ⅱ阻斷配體依賴的HER2∶HER3異源二聚體的形成，但不能阻斷配體非依賴的二聚體形成。

4、總的說來，Trastuzumab抑制配體非依賴HER2異源二聚體，而Pertuzumab抑制配體依賴的HER2異源二聚體，它們具有互補(bǔ)的抗腫瘤作用機(jī)理。研究表明Trastuzumab和Pertuzumab的聯(lián)合用藥可以有效抑制體內(nèi)外的腫瘤細(xì)胞增殖。2012年6月美國(guó)FDA已批準(zhǔn)trastuzumab聯(lián)合pertuzumab用于臨床治療HER2過表達(dá)轉(zhuǎn)移性乳腺癌。但雙抗體聯(lián)合治療的療效仍有所不足，其客觀緩解率僅為24％，完全緩解率不足8％

5、。因此，發(fā)展新型HER2靶向治療性抗體或者提供新的抗體組合治療策略顯得迫切重要。
　　本課題首先構(gòu)建了HER2分子胞外段基因的表達(dá)質(zhì)粒，通過真核轉(zhuǎn)染純化制備了HER2分子胞外段蛋白，利用其免疫小鼠使并通過雜交瘤技術(shù)篩選得到一株全新的抗HER2單克隆抗體7C3，競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)表明Trastuzumab和Pertuzumab均不能與7C3競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合HER2，提示7C3識(shí)別的抗原表位與Trastuzumab或Pertuzumab識(shí)別的表位均

6、不相同。我們利用免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)對(duì)7C3抑制配體依賴的HER2異源二聚化的能力進(jìn)行了評(píng)價(jià)。在SK-BR-3和BT-474乳腺癌細(xì)胞系中，7C3可以有效抑制EGF刺激的HER2∶EGFR異源二聚化。利用蛋白質(zhì)印跡法對(duì)7C3抑制HER2下游信號(hào)通路的能力進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示7C3單抗可以顯著降低MAPK磷酸化的水平，但對(duì)Akt磷酸化的影響不明顯。細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)表明7C3抗體能夠有效地抑制乳腺癌細(xì)胞的體外增殖。為了確定7C3的抗原表位，我們

7、對(duì)7C3和HER2膜外區(qū)蛋白進(jìn)行了共結(jié)晶，在3.1埃分辨率下解析了7C3∶HER2復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)，結(jié)晶數(shù)據(jù)表明7C3主要與HER2分子的結(jié)構(gòu)域Ⅲ結(jié)合，部分殘基與結(jié)構(gòu)域Ⅱ結(jié)合，但遠(yuǎn)離二聚化臂。重要的是，與游離的HER2分子結(jié)構(gòu)相比，當(dāng)7C3結(jié)合HER2時(shí)，HER2的二聚化臂發(fā)生了明顯的構(gòu)象改變。我們推測(cè):盡管7C3不直接與HER2分子二聚化臂結(jié)合，但可以通過與HER2結(jié)構(gòu)域Ⅲ的結(jié)合而使HER2分子發(fā)生構(gòu)象改變，進(jìn)而阻斷HER2異源二聚化的

8、形成及下游信號(hào)通路。
　　綜上所述，本課題發(fā)現(xiàn)了一種新的抗HER2單克隆抗體，與以往所有的HER2抗體不同的是，它能誘導(dǎo)HER2分子發(fā)生構(gòu)象改變。盡管其不直接與HER2分子二聚化臂結(jié)合，仍能有效抑制HER2分子二聚化，繼而阻斷HER2分子下游信號(hào)通路，抑制HER2過表達(dá)乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)。我們的研究結(jié)果還進(jìn)一步闡明了HER2分子結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系，為乳腺癌的治療提供了新的HER2靶向抗體制劑。這個(gè)新HER2抗體可能與以往的HER2靶向抗