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文檔簡介
1、凝集素是一類具有一個或多個可與單糖或寡糖可逆特異性結(jié)合的非催化結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì),在動物、植物和微生物中廣泛存在。植物凝集素在病原菌防御、細胞識別、細胞生長控制、胞內(nèi)物質(zhì)運輸?shù)榷喾N生理生化現(xiàn)象中具有重要作用。
本文以傳統(tǒng)的藥食兩用蔥屬植物——藠頭(Allium chinense)為材料,通過分離純化得到一種藠頭凝集素(Allium chinense lectin,ACL)蛋白,并進行了鑒定、克隆和重組表達及抗腫瘤活性研究。
2、r> 采用磷酸緩沖液(PBS,pH7.3)對研磨的新鮮藠頭鱗莖進行抽提,飽和硫酸銨沉淀法進行粗分離,然后經(jīng)Q Sepharose強陰離子交換色譜和Superdex200葡聚糖凝膠色譜分離得到SDS-PAGE單一條帶蛋白,質(zhì)譜鑒定結(jié)果顯示該蛋白可能為一種甘露糖結(jié)合凝集素。血凝活性研究表明ACL對兔血紅細胞凝集活性高,熱穩(wěn)定性較好,在極端酸性環(huán)境中較穩(wěn)定,且僅有甘露糖對ACL的凝集作用具有抑制效果。
Trizol法提取藠
3、頭總RNA,反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。以第一鏈cDNA為模板,根據(jù)已知蔥屬植物凝集素基因保守區(qū)序列設(shè)計引物,PCR擴增獲得約320 bp片段,參照hiTAIL-PCR方法擴增其側(cè)翼序列,根據(jù)所得3’端和5’端序列設(shè)計特異引物,PCR獲得該基因ORF序列,共456 bp,編碼151個氨基酸。根據(jù)核苷酸序列推導(dǎo)氨基酸序列,可知ACL中包含3個已知的甘露糖結(jié)合位點QDNY,進一步驗證ACL為甘露糖特異性結(jié)合凝集素。利用BLAST對核苷酸和氨基
4、酸序列分別進行同源性比對分析,結(jié)果顯示,該基因與其它凝集素核苷酸序列同源性介于76%-91%,氨基酸序列同源性在47%-89%。本研究構(gòu)建了大腸桿菌重組表達質(zhì)粒pET28a-ACL并轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3),成功得到ACL融合蛋白,HisTrap親和色譜純化融合蛋白,免疫家兔制備多克隆抗體,為深入研究ACL與腫瘤細胞的相互作用機制提供了基礎(chǔ)。
天然和重組ACL分別作用于人肝癌細胞(Hep-3B)和人臍帶靜脈內(nèi)皮
5、細胞(HUVEC),MTT實驗結(jié)果表明,native-ACL和recombinant-ACL都能明顯抑制Hep-3B細胞增殖、降低腫瘤細胞活性,且native-ACL對HUVEC細胞增殖無顯著影響。DNA片段化實驗中,native-ACL處理組Hep-3B細胞DNA在瓊脂糖凝膠檢測時出現(xiàn)明顯“梯狀”條帶。經(jīng)DAPI、tubulin Alexa Fluor488和Mito TrackerRed CMVRos分別對細胞進行免疫熒光染色后在激
6、光共聚焦顯微鏡下檢測,結(jié)果顯示native-ACL處理后Hep-3B細胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)上都發(fā)生了變化:細胞皺縮成圓形,細胞核呈現(xiàn)多形化,微管蛋白凝聚導(dǎo)致細胞骨架破壞,線粒體跨膜電位出現(xiàn)崩解。而native-ACL處理HUVEC細胞和未處理的陰性對照組細胞形態(tài)、細胞骨架等都沒有明顯差異。同時,利用anti-ACL一抗和熒光染料偶聯(lián)的二抗對native-ACL在細胞中的定位進行,結(jié)果表明在ACL處理后的細胞胞漿中熒光明顯,說明native-AC
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