uPA的ATF與PAI-2CD雙功能融合蛋白的研制及其抗腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移作用的研究.pdf

1、侵襲轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤病人死亡的主要原因.現(xiàn)在對(duì)侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)理已有了較為深入的研究,侵襲轉(zhuǎn)移主要包括血管生成、粘附、蛋白水解、遷移和增殖等步驟.如何有效抑制侵襲轉(zhuǎn)移的各個(gè)步驟,成為抗腫瘤治療的研究重點(diǎn).十幾年的研究表明,尿激酶型纖溶酶原激活劑(urokinase plaminogen activator,uPA)及其受體(uPA receptor,uPAR)系統(tǒng)除在細(xì)胞外的蛋白水解中發(fā)揮關(guān)鍵作用外,還在血管生成、粘附、遷移和增殖等腫瘤侵襲轉(zhuǎn)

2、移的多個(gè)步驟中起著重要作用.故uPA/uPAR系統(tǒng)成為腫瘤抗侵襲轉(zhuǎn)移治療的靶標(biāo)蛋白質(zhì).抑制uPA/uPAR的活性和干擾uPA與uPAR的之間的相互作用是腫瘤抗侵襲轉(zhuǎn)移治療研究的基本策略和思路,通過基因工程及蛋白質(zhì)工程,把與uPAR結(jié)合的uPA氨基末端片段(amino-terminal fragment,ATF)的cDNA通過含十一個(gè)氨基酸殘基的連接肽編碼序列與缺失了CD螺旋間區(qū)第33~98位氨基酸殘基的、不再具有抵抗TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞

3、凋亡作用的PAI-2突變體(PAI-2CD)cDNA重組成融合蛋白基因(ATF-PAI2CD),分別在酵母和大腸桿菌中表達(dá).用改良Boyden小室分析PAI-2CD及融合蛋白對(duì)人巨細(xì)胞肺癌細(xì)胞95D株的體外侵襲能力的影響,在1、5、10、50、100、500、1000nmol/L濃度下,經(jīng)PAI-2CD處理的95D細(xì)胞穿過Matrigel的細(xì)胞數(shù)分別為80.33±3.78、76.50±5.21、69.83±5.04、65.67±6.77

4、、56.67±5.50、33.17±5.19、15.12±3.74,經(jīng)ATF-PAI2CD融合蛋白處理的95D細(xì)胞穿過Matrigel的細(xì)胞數(shù)分別為87.5±4.03、73.24±4.10、47.33±4.13、29.17±2.48、13.50±2.07、10.83±1.47、9.83±1.33.與對(duì)照組相比,除1nmol/L低劑量組外,PAI-2CD及ATF-PAI2CD兩種蛋白都能劑量依賴性的抑制95D細(xì)胞體外侵襲(具有顯著性差異,

5、P<0.05).融合蛋白ATF-PAI2CD抑制95D細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC<,50>)約10nmol/L,而PAI-2CD抑制95D細(xì)胞的IC<,50>約250nmol/L,顯示ATF-PAI2CD具有更強(qiáng)的抑制95D細(xì)胞體外侵襲能力(具有顯著性差異,p<0.05).說明融合蛋白的雙功能作用比PAI-2CD的只具纖溶抑制活性更為有效.按5×10<'6>細(xì)胞/只將95D細(xì)胞接種于5周齡雌性BALB/c nu/nu裸小鼠肩胛部皮下,隨機(jī)