ezrin蛋白介導(dǎo)幽門(mén)螺桿菌促胃癌侵襲轉(zhuǎn)移作用及其機(jī)制初探.pdf

1、胃癌目前仍是我國(guó)死亡人數(shù)最多的惡性腫瘤之一,轉(zhuǎn)移是腫瘤最具破壞性的本質(zhì),也是胃癌患者死亡的主要原因。深刻理解胃癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制對(duì)指導(dǎo)治療十分重要。H.pylori感染是胃癌的重要危險(xiǎn)因素,世界衛(wèi)生組織已將H.pyori列為Ⅰ類(lèi)致癌原,對(duì)于H.pylori感染對(duì)胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移力有無(wú)影響,尚存在爭(zhēng)論。H.pylori感染胃癌細(xì)胞可使腫瘤轉(zhuǎn)移關(guān)鍵蛋白ezrin蛋白表達(dá)及功能發(fā)生變化,H.pylori感染是否能通過(guò)影響ezrin及其相關(guān)分子影響

2、胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移,是本課題的需驗(yàn)證的設(shè)想。
　　 目的:1、明確H.pylori感染與胃癌侵襲、轉(zhuǎn)移是否相關(guān);2、如果二者相關(guān),探討ezrin是否H.pylori感染與與胃癌侵襲、轉(zhuǎn)移中起重要的作用;3、初步探討ezrin在胃癌侵襲轉(zhuǎn)移中可能分子機(jī)制,為H.pylori感染促胃癌進(jìn)展提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:1、利用手術(shù)切除人體胃癌標(biāo)本,聯(lián)合血清H.pylori抗體檢測(cè)及快速尿素酶法檢測(cè)H.pylori感染狀態(tài),探討

3、H.pylori感染與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、胃癌浸潤(rùn)深度、病理分型的相關(guān)性;利用H.pylori與胃腺癌細(xì)胞AGS體外共培養(yǎng),掃描電鏡觀察H.pylori感染AGS細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變,transwell小室檢測(cè)H.pylori對(duì)AGS細(xì)胞侵襲力的影響;劃痕實(shí)驗(yàn)觀察H.pylori對(duì)AGS細(xì)胞遷移力的影響;MTT法檢測(cè)H.pylori感染對(duì)AGS細(xì)胞失巢存活力的影響;2、免疫組化檢測(cè)ezrin在胃癌組織中的表達(dá),并探討其表達(dá)強(qiáng)弱與胃癌浸潤(rùn)深度,有

4、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、是否有H.pylori感染的關(guān)系;免疫組化檢測(cè)胃癌組織中CD44及E-cadherin的表達(dá),探討與H.pylori感染是否相關(guān)。選取AGS、MKN28、BGC823三種胃癌細(xì)胞株,western blot檢測(cè)三種細(xì)胞株ezrin的表達(dá),transwell小室檢測(cè)侵襲力的高低,并探討ezrin表達(dá)和侵襲力強(qiáng)弱的關(guān)系;以侵襲力最弱的MKN28細(xì)胞株為研究對(duì)象,設(shè)立H.pylori感染組與PBS對(duì)照組,觀察兩組細(xì)胞侵襲力是否有

5、差異,并用western blot檢測(cè)ezrin及其相關(guān)蛋白CD44、E-cadhrin的表達(dá)和ezrin上游調(diào)控因子Sixl的表達(dá)。3、構(gòu)建VIL-2(ezrin編碼基因)的RNA干涉真核表達(dá)載體以及陰性對(duì)照載體。將干涉載體利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染侵襲力最強(qiáng)的AGS細(xì)胞,經(jīng)G418抗性篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株AGSezrin。半定量RT-PCR及western blot檢測(cè)沉默效應(yīng)。分別將AGS+PBS、AGS+H.pylori、AGSezri

6、n+PBS、AGSezrin+H.pylori四組細(xì)胞為研究對(duì)象,掃描電鏡細(xì)胞觀察形態(tài)特征的變化,通過(guò)MTT、侵襲小室實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)、黏附實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞的失巢存活、侵襲和遷移、黏附能力。Western blot檢測(cè)ezrin、E-cadherin、CD44表達(dá)的變化。
　　 結(jié)果:1.①103例患者中,血清抗H.pylori抗體陽(yáng)性71例,快速尿酶法陽(yáng)性67例,二者均陽(yáng)性60例,二者均陰性23例。共83例患者入組,H.pylo

7、ri陽(yáng)性患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移36例(60％),H.pylori陰性患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移5例(21.7％),H.pylori陽(yáng)性患者與H.pylori陰性患者發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率顯著差異(p＜0.05);H.pylori感染與腫瘤浸潤(rùn)深度評(píng)分無(wú)關(guān)(p＞0.05),腸型胃癌45例,其中H.pylori陽(yáng)性率為75.6％(34/45),高于彌漫型胃癌癌灶H.pylori陽(yáng)性率為42.1％(16/38),差異顯著(p＜0.05)。②H.pylori與AGS細(xì)胞

8、共培養(yǎng),觀察到細(xì)胞變形,相互分散,出現(xiàn)“蜂鳥(niǎo)表型”及空泡樣變。電鏡下觀察H.pylori感染AGS細(xì)胞24小時(shí),細(xì)胞變?yōu)殚L(zhǎng)梭形,伸出細(xì)長(zhǎng)偽足。③AGS細(xì)胞與H.pylori共孵育后行transwell實(shí)驗(yàn),每200倍鏡視野下穿膜細(xì)胞數(shù)130.4±11.5,高于PBS對(duì)照組87.1±9.3,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。④遷移實(shí)驗(yàn)中加入H.pylori的AGS細(xì)胞遷移距離均明顯大于PBS對(duì)照組細(xì)胞。⑤H.pylori感染的細(xì)胞失巢培

9、養(yǎng)24小時(shí),細(xì)胞生存率高于PBS對(duì)照組(P＜0.05)。2.①H.pylori陽(yáng)性患者胃癌組織中ezrin蛋白表達(dá)強(qiáng)度高于H.pylori陰性患者(P＜0.05),ezrin蛋白與胃癌浸潤(rùn)深度無(wú)關(guān)(P＞0.05),有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者胃癌組織ezrin的免疫活性顯著強(qiáng)于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者(P＜0.05),H.pylori感染與胃癌組織中CD44表達(dá)無(wú)關(guān)(P＞0.05),H.pylori陽(yáng)性患者較H.pylori陰性患者胃癌組織中E-cad

10、herin蛋白表達(dá)顯著降低(P＜0.05)。②檢測(cè)三種細(xì)胞系侵襲力,侵襲力最強(qiáng)的是AGS,其次為BGC823,最弱為MKN28。Ezrin蛋白在三種細(xì)胞系中表達(dá)從高到低依次為AGS,BGC823,MKN28,在此三種細(xì)胞系中,ezrin的表達(dá)強(qiáng)弱與侵襲力高低一致。③以侵襲力最弱的MKN28為研究對(duì)象,加入H.pylori的感染組細(xì)胞,24小時(shí)穿膜數(shù)量為51.5±5.5,加入同體積的PBS的陰性對(duì)照組細(xì)胞,24小時(shí)穿膜數(shù)量為32.7±6.

11、2。二者比較,H.pylori感染組顯著多于陰性對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),④H.pylori對(duì)MKN28細(xì)胞侵襲力的促進(jìn)作用大于對(duì)AGS細(xì)胞的作用(P＜0.05)。H.pylori感染促進(jìn)MKN28細(xì)胞中ezrin、CD44蛋白表達(dá),且差異顯著(P＜0.05,P＜0.05)降低E-cadherin在MKN28中的表達(dá)(P＜0.05),增加ezrin上游調(diào)控蛋白sixl的表達(dá)。3、①成功構(gòu)建針對(duì)ezrin轉(zhuǎn)錄基因(VIL

12、2)的3種特異性干擾質(zhì)粒,通過(guò)western blot及RT-PCR篩選感染效果最強(qiáng)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染侵襲力最強(qiáng)、ezrin表達(dá)最高的AGS細(xì)胞,經(jīng)G418篩選建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染該感染質(zhì)粒的AGSezrin細(xì)胞系:②掃描電子顯微鏡觀察細(xì)胞表面形態(tài)學(xué)變化,AGS細(xì)胞呈橢圓形或長(zhǎng)梭形,細(xì)胞表面粗糙,分布粗短的葉狀偽足;加入100:1(細(xì)菌/細(xì)胞)H.pylori后,可見(jiàn)H.pylori黏附于細(xì)胞表面,細(xì)胞表面粗短突起減少,但細(xì)胞沿長(zhǎng)軸伸出兩細(xì)長(zhǎng)突起,長(zhǎng)度

13、大于2倍細(xì)胞直徑,AGSezrin細(xì)胞呈多邊形或類(lèi)圓形,細(xì)胞表面向四周伸出較多細(xì)長(zhǎng)絲狀偽足,可見(jiàn)較豐富的細(xì)胞間連接,亦見(jiàn)凋亡細(xì)胞;加入100:1(細(xì)菌/細(xì)胞)H.pylori后,細(xì)胞表面幾乎被黏附的Hpylori覆蓋,細(xì)胞仍呈多邊形,細(xì)胞向周邊輻射狀伸出絲狀偽足。掃描電鏡放大4000倍,AGS表面黏附的H.pylori數(shù)量為:24.2±11.5,AGSezrin細(xì)胞表面黏附的H.pylori數(shù)量為:51.4±13.1,顯著多于AGS細(xì)胞

14、(P＜0.05);③AGS細(xì)胞的黏附率為(76.2±11.7)％,AGSezrin細(xì)胞的黏附率為(90.5±7.6)％,二者比較(P＜0.05),差異顯著,10:1比例H.pylori感染AGS及AGSezrin細(xì)胞,黏附率分別為(61.8±8.5)％,(92.4±7.3)％,H.pylori感染AGS組細(xì)胞黏附率與AGS組比較,顯著下降(P＜0.05);⑤侵襲實(shí)驗(yàn)中200倍鏡下平均每視野AGSEzrin細(xì)胞的跨膜數(shù)為27.67±4.5

15、0,與AGS細(xì)胞125.50±8.33比較差異顯著(P＜0.05),AGSezrin細(xì)胞+H.pylori,跨膜細(xì)胞數(shù)為31.25±6.10,與AGSEzrin細(xì)胞比較,無(wú)顯著差異;AGSezrin的遷移距離明顯小于AGS細(xì)胞的遷移距離。而H.pylori感染對(duì)AGSezrin細(xì)胞遷移無(wú)明顯影響;H.pylori感染的AGSezrin細(xì)胞在失巢生存率略低于PBS對(duì)照組,但無(wú)顯著性差異(P＞0.05);⑥H.pylori感染增加AGS細(xì)胞