N1-取代咖啡酰吡咯烷衍生物-LY52抗腫瘤侵襲與轉移作用研究.pdf

1、腫瘤侵襲與轉移是指癌細胞脫離原發(fā)部位，侵入新環(huán)境并生長的過程。主要包括：1．癌細胞穿過基底膜；2．侵入原發(fā)部位血管、淋巴管；3．侵入繼發(fā)部位并降解和穿透基底膜；4．在繼發(fā)部位生長?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetall proteinases，MMPs)降解基底膜對上述過程起到核心作用。在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的28種MMPs中，根據(jù)其特異性降解底物不同，分為4類，即膠原酶、明膠酶(IV型膠原酶)、間質(zhì)溶解素和基質(zhì)溶解素。其中，明膠酶(MMP-2和

2、MMP-9)降解膠原蛋白，是產(chǎn)生浸潤與轉移的核心酶。因此，以IV型膠原酶為靶點設計新型藥物是抗轉移研究的熱門課題。以X線衍射技術研究MMPs的3-D結構，發(fā)現(xiàn)明膠酶的活性結合腔(active S’l pock of matrix metalloproteinase)具有比MMP．3更狹長的特點。因此，徐文方等參考MMP-3抑制劑結構，設計合成了以結構細長，柔性較高為特點的吡咯烷連接咖啡酰為基本骨架的全新結構化合物，N1-取代咖啡酰吡咯烷

3、衍生物。在設計理論上，已經(jīng)具備較易進入明膠酶active S’<,l> pocket的能力。本項研究是在體內(nèi)外初步活性篩選有效基礎上，選擇其中的典型化合物-LY52，進一步研究其活性作用并探討機制。 1．瘤細胞生長抑制實驗 (1)體外實驗：以MTT法檢測LX52對人卵巢上皮癌SKOV3和人喉上皮細胞癌-IIep-2的生長抑制作用。結果顯示，LY52對腫瘤細胞僅有較弱的生長抑制作用。(2)體內(nèi)實驗：以100mg/Kg劑量

4、口服給藥，LY52對S180小鼠肉瘤有一定的抑制作用，對小鼠體重沒有明顯影響。 2．腫瘤細胞黏附性抑制實驗 (1)細胞-基質(zhì)蛋白黏附實驗：與LY52孵育12h，MTT法測定細胞與基底膜蛋白的黏附能力，顯示LY52能夠分別降低SKOV3和Hep-2與FN，LN和Matrigel的黏附性。 (2)CD44表達實驗：以流式細胞儀測定了腫瘤細胞表面黏附分子CD44表達，結果顯示LY52對CD44表達有較弱的抑制作用。

5、 3．明膠酶活性實驗 (1)以琥珀酰明膠降解法，觀察到LY52具有直接抑制明膠酶降解琥珀酰明膠的作用。 (2)SDS-PAGE明膠酶譜分析細胞培養(yǎng)上清液MMPs活性，發(fā)現(xiàn)LY52對SKOV3細胞MMP-2和-9的表達具有明顯的劑量依賴性抑制作用關系；對Hep-2細胞表達MMP-2的活性也有很強的抑制作用。 4．MMP-2，-9表達抑制實驗 (1)免疫細胞化學分析法發(fā)現(xiàn)，LY52對體外培養(yǎng)的SKOV3細

6、胞MMP-2和MMP-9表達具有很強的抑制作用；對Hep-2細胞MMP-2的表達也有抑制作用。 (2)免疫組織化學法，分析裸鼠體內(nèi)生長的SKOV3和Hep-2組織細胞MMP-2，-9表達水平，結果顯示，LY52能夠抑制SKOV3組織細胞MMP-2和MMP-9的表達；對Hep-2細胞MMP-2也有較弱的抑制作用。 5．腫瘤轉移抑制實驗 (1)重組基底膜實驗：以transwell chamber實驗法觀察了IY52對

7、SKOV3和Hep-2細胞穿過人工基底膜的影響。LY52能夠明顯減少穿過人工基底膜細胞的數(shù)量，顯示具有抗癌細胞侵襲與游走的能力。 (2)小鼠Lewis肺癌轉移抑制實驗：以C57BL/BL6小鼠接種Lewis肺癌細胞肺轉移模型，觀察了LY52對其自發(fā)性肺轉移的抑制作用，100 mg/Kg能夠有效降低肺表面的轉移瘤灶數(shù)量。 (3)B16-F10黑色素瘤肺轉移抑制實驗：以C57BIJBL6小鼠尾靜脈注射B16-F10細胞法，

8、LY52能夠降低小鼠肺表面轉移灶的數(shù)量。 6．微血管形成實驗 (1)VEGF表達實驗：免疫組化法檢測了裸鼠體內(nèi)生長的人腫瘤組織SKOV3和Hep-2的VEGF表達，顯示LY52對腫瘤組織血管內(nèi)皮細胞VEGF表達有明顯的抑制作用。 (2)MVD評價法：以CD34表達水平評價腫瘤微血管密度MVD，顯示LY52對人SKOV3和Hep-2細胞的腫瘤組織微血管形成因子CD34表達具有一定的抑制作用。 (3)雞胚尿囊

9、膜(CAM)血管生成實驗：LY52直接與雞胚尿囊膜(CAM)接觸，能夠明顯地抑制CAM血管生成作用。 結論：LY52特異性地與癌細胞MMP-2，-9結合并抑制活性表達，癌細胞降解基底膜的能力降低；LY52并能阻滯癌細胞與基底膜(BM)蛋白的黏附性，細胞游走能力減弱，穿過人工基底膜的能力下降；由于BM的降解產(chǎn)物減少，腫瘤微血管形成能力降低；以Lewis肺癌和B16-F10黑色素瘤細胞肺轉移實驗證實了LY52對MMP-2，-9活性的