Riccardin D靶向DNA拓撲異構(gòu)酶Ⅱ的抗腫瘤作用研究.pdf

1、目的：拓撲異構(gòu)酶是一種真核生物生存所必需的核酶，可介導DNA單鏈或雙鏈的瞬時斷裂和再連接，在DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、重組及染色體分離等多個環(huán)節(jié)發(fā)揮重要作用。根據(jù)其誘導DNA斷裂方式的不同，分為拓撲異構(gòu)酶Ⅰ和拓撲異構(gòu)酶Ⅱ，以拓撲異構(gòu)酶為靶點的抗癌作用成為化療藥物研究的一個重要方向。臨床上許多一抗腫瘤藥物以拓撲異構(gòu)酶為作用靶點，取得了一定臨床療效。但在應(yīng)用過程中仍出現(xiàn)一些問題：多藥耐藥性的產(chǎn)生，因長期使用拓撲異構(gòu)酶毒劑而出現(xiàn)的繼發(fā)性急性髓樣白血病

2、以及心臟毒性。因此，開發(fā)安全，高效，低毒以及可逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的以拓撲異構(gòu)酶為靶點的化療藥物意義重大。RiccardinD是從苔蘚類植物Dumortiera hirsuta分離所得的一種新型的大環(huán)雙聯(lián)卞類化合物。前期研究表明，RiccardinD可以抑制真菌被膜的形成，它的類似物羽苔素E可以逆轉(zhuǎn)真菌耐藥和腫瘤耐藥，另一類似物地錢素C可以通過誘導微管解聚進而導致細胞凋亡最終發(fā)揮抗腫瘤作用，還可將腫瘤細胞阻滯在G2/M期抑制其增殖。本研究是基于

3、前期研究結(jié)果推測RiccardinD可能會具有抗腫瘤及逆轉(zhuǎn)多藥耐藥作用。
　　 方法：⑴選用人慢性骨髓性白血病細胞株K562及人急性粒細胞白血病細胞株HL60，MTT法檢測不同濃度riccardinD對白血病細胞增殖的抑制作用，Hoechst33258，F(xiàn)ITC-AnnexinⅤ雙染法及DNA Ladder檢測riccardinD對白血病細胞凋亡的影響。Western blotting檢測riccardinD對凋亡蛋白Caspa

4、se-3，Caspase-9，cleaved PARP表達的影響。RT-PCR檢測riccardinD對細胞凋亡抑制因子Bcl-2與細胞凋亡促進因子Bax-α比值的影響。最后檢測線粒體和死亡受體介導的兩條凋亡通路中的關(guān)鍵分子Cytochrome c及Caspase-8分析riccardinD可能介導的凋亡通路。⑵以pBR322 DNA為作用底物，etoposide為陽性對照，檢測riccardinD對拓撲異構(gòu)酶Ⅰ和拓撲異構(gòu)酶Ⅱ活性的影響

5、。將riccardinD作用于K562細胞后，提取其拓撲異構(gòu)酶Ⅱ，檢測riccardinD對細胞內(nèi)拓撲異構(gòu)酶Ⅱ活性的影響。實時定量RT-PCR檢測riecardin D對DNA拓撲異構(gòu)酶Ⅱα基因表達的影響。SPR分析進一步檢測riccardinD與拓撲異構(gòu)酶Ⅱα間的結(jié)合能力。選用拓撲異構(gòu)酶Ⅱα缺陷型細胞株HL60/MX2及構(gòu)建拓撲異構(gòu)酶Ⅱα高表達細胞系K562/TopoⅡα檢測riccaxdinD對兩種細胞增殖的影響。⑶體外法，選取非小

6、細胞肺癌細胞H460及A549，采用MIT，Hoechst33258及FITC-AnnexinⅤ雙染法檢測riccardinD對非小細胞肺癌細胞凋亡的影響。另外，劃痕試驗、重組基底膜侵襲與轉(zhuǎn)移及明膠酶活性測定試驗檢測riccardinD對非小細胞肺癌細胞侵襲及轉(zhuǎn)移能力的影響。體內(nèi)法，以H460細胞接種裸鼠腋下，待腫瘤長至100mm3-300mm3開始尾靜脈注射給予riccardinD，三天一次，給藥三周。給藥結(jié)束后，取瘤組織稱重，計算抑

7、瘤率。取瘤塊進行Western blotting及TUNEL試驗檢測riccardinD體內(nèi)抑瘤作用及對腫瘤組織內(nèi)凋亡蛋白Caspase-3，Caspase-9，cleaved PARP及侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白MMP-2，MMP-9，VEGF及Erk1/2的影響。⑷選用兩株耐藥株K562/A02及H460/RT，分別是阿霉素和紫杉醇耐藥株。采用MTT法檢測riccardinD單用，阿霉素與riccardinD合用，紫杉醇和riccardinD

8、合用后對耐藥細胞的抑制作用，計算合用后藥物逆轉(zhuǎn)倍數(shù)。以逆轉(zhuǎn)作用較強的紫杉醇和riccardinD合用組進行裸鼠試驗，以H460/RT細胞接種裸鼠腋下，待腫瘤生長至100mm3-300mm3時給予riccardinD和紫杉醇。給藥結(jié)束，取瘤組織稱重，計算抑瘤率。取瘤組織檢測凋亡蛋白及耐藥蛋白表達。另外，檢測riccardinD對K562/A02細胞凋亡蛋白，耐藥蛋白及基因表達水平的影響。
　　 結(jié)果：①MTT結(jié)果顯示，以ricca

9、rdin D(10μM-60μM)分別與K562，HL60細胞孵育24h，48h，72h，最高抑制率90.6％。Hoechst33258結(jié)果顯示，10μM，20μM和30μM riccardin D明顯誘導細胞凋亡，孵育48h，細胞核染色質(zhì)濃染，固縮或集聚核膜周邊、或呈塊狀碎裂改變。FITC-AnnexinⅤ雙染結(jié)果顯示，10μM riccardinD處理K562細胞24h凋亡率為25.55％，HL60凋亡率為27.56％。DNA La

10、dder結(jié)果顯示，riccardin D處理后產(chǎn)生明顯DNA梯狀片段。Western blot結(jié)果顯示，10μM-40μM riccardin D顯著增加K562和HL60細胞的Caspaso-3，Caspaso-9，cleaved PARP蛋白表達水平。RT-PCR顯示，riccardin D可顯著降低Bcl-2 mRNA水平，增加Bax-α mRNA水平，8cl-2/Bax-α比值明顯降低。此外，10μM-40μMriccardin

11、 D可顯著增加K562細胞內(nèi)Cytochrome c釋放，而對procaspase-8蛋白表達水平無明顯影響。②拓撲異構(gòu)酶活性檢測顯示，riccardin D對拓撲異構(gòu)酶Ⅰ活性無明顯影響，而200μM-800μM riccardin D體外可明顯抑制拓撲異構(gòu)酶Ⅱ活性，呈現(xiàn)濃度劑量依賴關(guān)系，而且riccardin D對拓撲異構(gòu)酶Ⅱ活性的抑制作用明顯強于陽性對照etoposide。Riccardin D孵育后的K562細胞內(nèi)拓撲異構(gòu)酶Ⅱ活性

12、顯著降低。實時定量RToPCR檢測結(jié)果表明，riccardin D顯著降低K562細胞內(nèi)DNA拓撲異構(gòu)酶Ⅱα mRNA水平。以SPR技術(shù)分析顯示，riccardin D與拓撲異構(gòu)酶Ⅱ高度結(jié)合，結(jié)合常數(shù)KD為2.68E-06。進一步實驗，riccardin D對高表達拓撲異構(gòu)酶Ⅱ細胞抑制作用顯著，而對拓撲異構(gòu)酶Ⅱ缺陷型細胞株HL60/MX2抑制作用較弱，說明riccardin D可能通過靶向拓撲異構(gòu)酶Ⅱ產(chǎn)生抗癌作用。③MTT，Hoechs

13、t33258，F(xiàn)ITC-AnnexinⅤ雙染及Western blot試驗結(jié)果均顯示，riccardin D顯著抑制非小細胞肺癌細胞增殖，促進細胞凋亡及增加凋亡蛋白表達水平。劃痕試驗結(jié)果表明，51μM-10μM riccardin D抑制A549細胞向無細胞劃痕區(qū)遷移。Transwell侵襲試驗顯示，riccardin D抑制A549細胞穿透人工基底膜，當riccardin D濃度為5μM，10μM，20μM時，抑制率分別為40.7％，

14、56.5％，65.4％。明膠酶譜結(jié)果顯示，2.51μM，5μM，10μM riccardin D顯著抑制A549和H460細胞培養(yǎng)液中MMP-2，MMP-9活性。裸鼠移植瘤試驗顯示，riccardinD明顯抑制腫瘤組織生長，20mg/kg時抑制率為44.5％，且裸鼠體重下降不明顯。進一步檢查腫瘤組織，顯示TUNEL陽性染色水平增加，凋亡率為36.9％。④以10μM dccardin D與阿霉素聯(lián)合處理K562/A02可逆轉(zhuǎn)阿霉素耐藥，其

15、逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為2.31。以10μM riccardin D與紫杉醇聯(lián)合處理H460/RT可逆轉(zhuǎn)紫杉醇耐藥，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為8.42。Riccardin D與紫杉醇聯(lián)合處理接種H460/RT的裸鼠，riccardinD，紫杉醇單用組抑瘤率分別為46.8％和48.1％。而riccardin D與紫杉醇合用組腫瘤抑制率為57.3％.與單用組比較，合用組較單用組抑瘤率升高，且凋亡蛋白表達水平明顯升高，而耐藥蛋白表達水平顯著降低。電泳結(jié)果顯示，riccar