二去水衛(wèi)矛醇對(duì)肺癌NCI-H460細(xì)胞的影響及基于拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ探討其抗腫瘤作用.pdf

1、目的:評(píng)價(jià)二去水衛(wèi)矛醇(dianhydrogalactitol，DAG)對(duì)肺癌NCI-H460細(xì)胞的抗腫瘤作用，探討其抗腫瘤作用機(jī)制。
　　方法:(1) DAG對(duì)NCI-H460細(xì)胞增殖的影響。①采用CCK-8法、細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)，計(jì)算增殖抑制率及半數(shù)抑制濃度IC50，評(píng)價(jià)DAG對(duì)NCI-H460細(xì)胞的增殖抑制作用。②采用顯微拍照觀察不同濃度DAG給藥48 h后，肺癌NCI-H460細(xì)胞形態(tài)的改變。(2) DAG對(duì)NCI-H460

2、細(xì)胞遷移的影響。①采用劃痕實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)DAG對(duì)NCI-H460細(xì)胞橫向遷移的影響。②采用Transwell-migration小室模型評(píng)價(jià)DAG對(duì)NCI-H460細(xì)胞縱向遷移的影響。(3) DAG對(duì)NCI-H460細(xì)胞DNA、Ca2+和線粒體膜電位的影響。①采用Hoechst33342染色檢測(cè)DAG對(duì)細(xì)胞核染色質(zhì)的影響。②采用單細(xì)胞凝膠電泳檢測(cè)DAG對(duì)細(xì)胞DNA的損傷作用。③采用Fluo-3 AM為Ca2+熒光探針，檢測(cè)DAG對(duì)細(xì)胞內(nèi)Ca2

3、+的影響。④采用Rhodamine123(Rhm123)為線粒體膜電位熒光探針，檢測(cè)DAG對(duì)細(xì)胞線粒體膜電位的影響。(4)DAG對(duì)TopoⅡα、TopoⅡβ的影響。①采用Real-time PCR法檢測(cè)拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱα(TopoⅡα)、拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱβ(TopoⅡβ) mRNA的表達(dá)水平。②采用Western blot法檢測(cè)TopoⅡα、TopoⅡβ蛋白表達(dá)水平。③應(yīng)用計(jì)算機(jī)模擬分子對(duì)接技術(shù)預(yù)測(cè)DAG與TopoⅡα、TopoⅡβ的相互作用。

4、
　　結(jié)果:(1) CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示，DAG對(duì)NCI-H460細(xì)胞的體外抗腫瘤活性顯著，與對(duì)照組比較有顯著性差異，其48 h的IC50為9.68±1.02μg/mL。細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DAG能持續(xù)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。(2)劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell-migration小室檢測(cè)結(jié)果表明，DAG能抑制腫瘤細(xì)胞的遷移。(3) Hoechst33342檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，DAG使細(xì)胞核染色質(zhì)發(fā)生明顯改變，與空白對(duì)照組比

5、較，各給藥組細(xì)胞均不同程度出現(xiàn)細(xì)胞變圓縮小、貼壁能力減弱、胞漿內(nèi)顆粒邊緣化甚至細(xì)胞破碎等損傷現(xiàn)象;此外，單細(xì)胞凝膠電泳檢測(cè)出DAG可導(dǎo)致DNA損傷。Fluo-3 AM熒光染色結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，各給藥組熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，即細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加，說(shuō)明DAG誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡與細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加有關(guān);Rhm123熒光染色結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，各給藥組熒光強(qiáng)度減弱，表明DAG使細(xì)胞線粒體膜電位下降，即DAG誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡與線粒體膜電位

6、下降有關(guān)。(4) Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示不同濃度的DAG均能明顯降低TopoⅡα、TopoⅡβ mRNA表達(dá)量降低;Western blot檢測(cè)表明，DAG明顯使TopoⅡα、TopoⅡβ蛋白表達(dá)量降低，提示DAG誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡與下調(diào)TopoⅡα、TopoⅡβ有關(guān);計(jì)算機(jī)模擬分子對(duì)接顯示DAG與TopoⅡα、TopoⅡβ有相互結(jié)合作用。
　　結(jié)論:(1) DAG能顯著抑制NCI-H460細(xì)胞的增殖。(2) DAG能顯