甜菜夜蛾拓撲異構(gòu)酶Ⅰ氨基酸多型性對其活性的影響.pdf

1、DNA拓撲異構(gòu)酶Ⅰ(TopⅠ)參與機體內(nèi)的DNA復制、轉(zhuǎn)錄和重組反應(yīng)，是喜樹堿類化合物的作用靶標，其結(jié)構(gòu)變化會影響對喜樹堿類抑制劑的敏感性。本課題組通過對已知昆蟲TopⅠ氨基酸進行比對后，發(fā)現(xiàn)昆蟲TopⅠ在420，530，653和729四個位點存在多型性，這種多型性是否會影響昆蟲對喜樹堿類抑制劑的敏感性未見有報道。本研究通過對甜菜夜蛾TopⅠ基因進行定點突變、誘導表達及純化，研究了氨基酸多型性對TopⅠ解旋活性以及對喜樹堿類抑制劑敏感性

2、的影響，并以TopⅠ為靶標進行了非喜樹堿類抑制劑的初步篩選。取得如下研究結(jié)果:
　　完全重疊PCR能實現(xiàn)甜菜夜蛾TopⅠ定點突變，無其他突變引入。在選擇的濃度范圍內(nèi)，IPTG均能成功誘導目的蛋白表達，且表達量隨著IPTG濃度的增加而增加，但在相同濃度IPTG誘導下，突變蛋白的表達量較野生型明顯減少。
　　氨基酸多型性對甜菜夜蛾TopⅠ與鉀離子的親和性及解旋活性有影響。相同條件下，與野生型蛋白相比，突變蛋白對鉀離子的親和性均有

3、所增強，啟動解旋反應(yīng)時的鉀離子濃度較野生型蛋白低，最適鉀離子濃度也有所改變。在最適鉀離子濃度下，對DNA的解旋活性也存在差異。其中，L530P突變蛋白的最適鉀離子濃度為100mM，較野生型蛋白的最適鉀離子濃度(150mM)降低了30％，但兩者在最適鉀離子濃度下的催化活力一致，比活力均為1.28×109 U/mg pro;A653T突變蛋白對鉀離子的適宜濃度范圍增寬，在100 mM到200mM范圍內(nèi)的解旋活性均超過80％，但比活力較野生型

4、蛋白降低了50％，為6.40×108 U/mg pro; S729T突變蛋白的最適鉀離子濃度與野生型蛋白相同，為150mM，但催化活力較野生蛋白下降了75％，比活力為3.20×108 U/mg pro。
　　氨基酸多型性改變了甜菜夜蛾TopⅠ對喜樹堿類抑制劑的敏感性。同等條件下，在所選定的濃度范圍內(nèi)，L530P突變蛋白對伊立替康和拓撲替康完全喪失了敏感性，對喜樹堿和羥基喜樹堿的敏感性臨界濃度均為7.5μM，在此臨界濃度下，對羥基喜

5、樹堿的敏感性與野生型蛋白相當，對喜樹堿的敏感度下降了60％。A653T突變蛋白對喜樹堿、羥基喜樹堿、伊立替康和拓撲替康的敏感性臨界濃度分別為5.0μM、7.5μM、7.5μM和10.0μM，在此臨界濃度下，對伊立替康的敏感度較野生蛋白提高了28％，對喜樹堿、羥基喜樹堿和拓撲替康的敏感度則分別下降了40％、70％和80％;S729T突變蛋白對伊立替康和拓撲替康完全不敏感，對喜樹堿和羥基喜樹堿的敏感性臨界濃度分別為0.5μM和2.5μM，在

6、此臨界濃度下，對喜樹堿和羥基喜樹堿的敏感度分別下降了17％和24％。
　　氨基酸多型性對甜菜夜蛾TopⅠ與喜樹堿和羥基喜樹堿的結(jié)合速率亦有影響。在敏感性臨界濃度下，酶與喜樹堿和羥基喜樹堿充分結(jié)合所用時間存在差異。與野生型蛋白相比，L530P突變蛋白與喜樹堿的結(jié)合速率下降，酶的解旋活性依然存在，并在4 min時對體系內(nèi)超螺旋DNA100％解旋，而在野生型蛋白體系內(nèi)，酶活性被100％抑制;但L530P突變蛋白與羥基喜樹堿的結(jié)合速率增加

7、，在所測定時間范圍內(nèi)，酶完全失去解旋活性。A653T和S729T突變蛋白與喜樹堿的結(jié)合速率下降，完全消耗體系內(nèi)喜樹堿所用的時間分別為15 min和8 min，是野生型蛋白(4 min)的3.75倍和2倍;A653T與羥基喜樹堿的結(jié)合速率增加，充分結(jié)合時間為2 min，較野生型蛋白(4min)提前了2 min; S729T與羥基喜樹堿充分結(jié)合所用時間與野生型蛋白一致，均為4 min，但突變蛋白的羥基喜樹堿處理濃度（2.5μM）較野生型蛋白

8、（5.0μM）低，因而，結(jié)合速率有所下降。
　　通過DNA超螺旋解旋法，測定了羥基喜樹堿氯乙基異氰酸酯取代物對突變前后蛋白解旋活性的影響，發(fā)現(xiàn)該化合物對野生型蛋白保留了與其母體化合物羥基喜樹堿的抑制效果，對L530P和A653T突變蛋白的抑制率較母體化合物有所降低，最大抑制效率分別為20％和16％;對S729T的抑制效果則較母體化合物增加，最大抑制效率為100％。
　　利用體外酶活性檢測體系，測定了辛可寧，利血平，肉葉云香堿

9、，育亨賓鹽酸鹽，1-(3，4-二甲氧基芐基)-6，7-二甲氧基異喹啉鹽酸鹽，3-二甲基氨基甲基吲哚，阿托品，阿馬里新，鹽酸小檗堿，槲皮素和槐定堿11種化合物對拓撲異構(gòu)酶解旋活性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些化合物對TopⅠ均無抑制活性。
　　綜上所述，當甜菜夜蛾TopⅠ氨基酸序列中特定位點被替換后，酶的解旋活性和對抑制劑敏感性均發(fā)生相應(yīng)改變。深入開展氨基酸多型性與昆蟲TopⅠ對抑制劑敏感性之間的效應(yīng)關(guān)系研究，利用拓撲異構(gòu)酶體外表達系統(tǒng)，和酶