2023年全國(guó)碩士研究生考試考研英語(yǔ)一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁(yè)
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1、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ(TopⅠ)參與機(jī)體內(nèi)的DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和重組反應(yīng),是喜樹(shù)堿類化合物的作用靶標(biāo),其結(jié)構(gòu)變化會(huì)影響對(duì)喜樹(shù)堿類抑制劑的敏感性。本課題組通過(guò)對(duì)已知昆蟲(chóng)TopⅠ氨基酸進(jìn)行比對(duì)后,發(fā)現(xiàn)昆蟲(chóng)TopⅠ在420,530,653和729四個(gè)位點(diǎn)存在多型性,這種多型性是否會(huì)影響昆蟲(chóng)對(duì)喜樹(shù)堿類抑制劑的敏感性未見(jiàn)有報(bào)道。本研究通過(guò)對(duì)甜菜夜蛾TopⅠ基因進(jìn)行定點(diǎn)突變、誘導(dǎo)表達(dá)及純化,研究了氨基酸多型性對(duì)TopⅠ解旋活性以及對(duì)喜樹(shù)堿類抑制劑敏感性

2、的影響,并以TopⅠ為靶標(biāo)進(jìn)行了非喜樹(shù)堿類抑制劑的初步篩選。取得如下研究結(jié)果:
  完全重疊PCR能實(shí)現(xiàn)甜菜夜蛾TopⅠ定點(diǎn)突變,無(wú)其他突變引入。在選擇的濃度范圍內(nèi),IPTG均能成功誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá),且表達(dá)量隨著IPTG濃度的增加而增加,但在相同濃度IPTG誘導(dǎo)下,突變蛋白的表達(dá)量較野生型明顯減少。
  氨基酸多型性對(duì)甜菜夜蛾TopⅠ與鉀離子的親和性及解旋活性有影響。相同條件下,與野生型蛋白相比,突變蛋白對(duì)鉀離子的親和性均有

3、所增強(qiáng),啟動(dòng)解旋反應(yīng)時(shí)的鉀離子濃度較野生型蛋白低,最適鉀離子濃度也有所改變。在最適鉀離子濃度下,對(duì)DNA的解旋活性也存在差異。其中,L530P突變蛋白的最適鉀離子濃度為100mM,較野生型蛋白的最適鉀離子濃度(150mM)降低了30%,但兩者在最適鉀離子濃度下的催化活力一致,比活力均為1.28×109 U/mg pro;A653T突變蛋白對(duì)鉀離子的適宜濃度范圍增寬,在100 mM到200mM范圍內(nèi)的解旋活性均超過(guò)80%,但比活力較野生型

4、蛋白降低了50%,為6.40×108 U/mg pro; S729T突變蛋白的最適鉀離子濃度與野生型蛋白相同,為150mM,但催化活力較野生蛋白下降了75%,比活力為3.20×108 U/mg pro。
  氨基酸多型性改變了甜菜夜蛾TopⅠ對(duì)喜樹(shù)堿類抑制劑的敏感性。同等條件下,在所選定的濃度范圍內(nèi),L530P突變蛋白對(duì)伊立替康和拓?fù)涮婵低耆珕适Я嗣舾行?,?duì)喜樹(shù)堿和羥基喜樹(shù)堿的敏感性臨界濃度均為7.5μM,在此臨界濃度下,對(duì)羥基喜

5、樹(shù)堿的敏感性與野生型蛋白相當(dāng),對(duì)喜樹(shù)堿的敏感度下降了60%。A653T突變蛋白對(duì)喜樹(shù)堿、羥基喜樹(shù)堿、伊立替康和拓?fù)涮婵档拿舾行耘R界濃度分別為5.0μM、7.5μM、7.5μM和10.0μM,在此臨界濃度下,對(duì)伊立替康的敏感度較野生蛋白提高了28%,對(duì)喜樹(shù)堿、羥基喜樹(shù)堿和拓?fù)涮婵档拿舾卸葎t分別下降了40%、70%和80%;S729T突變蛋白對(duì)伊立替康和拓?fù)涮婵低耆幻舾?,?duì)喜樹(shù)堿和羥基喜樹(shù)堿的敏感性臨界濃度分別為0.5μM和2.5μM,在

6、此臨界濃度下,對(duì)喜樹(shù)堿和羥基喜樹(shù)堿的敏感度分別下降了17%和24%。
  氨基酸多型性對(duì)甜菜夜蛾TopⅠ與喜樹(shù)堿和羥基喜樹(shù)堿的結(jié)合速率亦有影響。在敏感性臨界濃度下,酶與喜樹(shù)堿和羥基喜樹(shù)堿充分結(jié)合所用時(shí)間存在差異。與野生型蛋白相比,L530P突變蛋白與喜樹(shù)堿的結(jié)合速率下降,酶的解旋活性依然存在,并在4 min時(shí)對(duì)體系內(nèi)超螺旋DNA100%解旋,而在野生型蛋白體系內(nèi),酶活性被100%抑制;但L530P突變蛋白與羥基喜樹(shù)堿的結(jié)合速率增加

7、,在所測(cè)定時(shí)間范圍內(nèi),酶完全失去解旋活性。A653T和S729T突變蛋白與喜樹(shù)堿的結(jié)合速率下降,完全消耗體系內(nèi)喜樹(shù)堿所用的時(shí)間分別為15 min和8 min,是野生型蛋白(4 min)的3.75倍和2倍;A653T與羥基喜樹(shù)堿的結(jié)合速率增加,充分結(jié)合時(shí)間為2 min,較野生型蛋白(4min)提前了2 min; S729T與羥基喜樹(shù)堿充分結(jié)合所用時(shí)間與野生型蛋白一致,均為4 min,但突變蛋白的羥基喜樹(shù)堿處理濃度(2.5μM)較野生型蛋白

8、(5.0μM)低,因而,結(jié)合速率有所下降。
  通過(guò)DNA超螺旋解旋法,測(cè)定了羥基喜樹(shù)堿氯乙基異氰酸酯取代物對(duì)突變前后蛋白解旋活性的影響,發(fā)現(xiàn)該化合物對(duì)野生型蛋白保留了與其母體化合物羥基喜樹(shù)堿的抑制效果,對(duì)L530P和A653T突變蛋白的抑制率較母體化合物有所降低,最大抑制效率分別為20%和16%;對(duì)S729T的抑制效果則較母體化合物增加,最大抑制效率為100%。
  利用體外酶活性檢測(cè)體系,測(cè)定了辛可寧,利血平,肉葉云香堿

9、,育亨賓鹽酸鹽,1-(3,4-二甲氧基芐基)-6,7-二甲氧基異喹啉鹽酸鹽,3-二甲基氨基甲基吲哚,阿托品,阿馬里新,鹽酸小檗堿,槲皮素和槐定堿11種化合物對(duì)拓?fù)洚悩?gòu)酶解旋活性的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些化合物對(duì)TopⅠ均無(wú)抑制活性。
  綜上所述,當(dāng)甜菜夜蛾TopⅠ氨基酸序列中特定位點(diǎn)被替換后,酶的解旋活性和對(duì)抑制劑敏感性均發(fā)生相應(yīng)改變。深入開(kāi)展氨基酸多型性與昆蟲(chóng)TopⅠ對(duì)抑制劑敏感性之間的效應(yīng)關(guān)系研究,利用拓?fù)洚悩?gòu)酶體外表達(dá)系統(tǒng),和酶

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