DNA拓撲異構酶-Ⅱα對腫瘤干細胞在膠質母細胞瘤增殖機制中作用的研究.pdf

1、目的：
　　 多形性膠質母細胞瘤(gdio blastoma multiforme,GBM)是最常見的惡性程度最高的顱內原發(fā)性腫瘤,雖采用各種手段綜合治療,但療效仍不理想。腫瘤干細胞(cancerstemcells,CSCs)是指存在于腫瘤當中具有干細胞特性的一組細胞集群,在腫瘤發(fā)生增殖過程中起關鍵作用。本研究擬在已成功分離鑒定GBM的CSCs及對增殖相關因子DNA拓撲異構酶-Ⅱα(Topoisomerase-Ⅱα,Topo-Ⅱ

2、α)與GBM增殖關系研究的前期工作基礎上,分離GBM的CSCs與非腫瘤干細胞(non-cancerstemcells,non-CSCs)兩種細胞,進行體外培養(yǎng);應用Westernblot及Real-timePCR等分子生物學手段研究Topo-Ⅱα的表達差異;應用RNA干擾技術沉默Topo-Ⅱα的表達,研究Topo-Ⅱα對CSCs增殖、凋亡等生物學特性的影響;進一步應用Topo-Ⅱα抑制劑進行干預,研究細胞增殖及細胞凋亡信號傳導通路的變化

3、,明確Topo-Ⅱα及其抑制劑對CSCs在腫瘤增殖過程中作用的影響及機制。本項研究不僅能在分子水平上闡明GBM的發(fā)病機理,還將為GBM的治療提供重要的理論和實驗依據。
　　 方法：
　　 選購人腦膠質母細胞瘤U87MG細胞系模型進行體外培養(yǎng),應用含生長因子的干細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)約1-2周,分離和鑒定其中的CSCs及non-CSCs;應用Westernblot及Real-timePCR法檢測CSCs及non-CSCs中Topo

4、-Ⅱα的表達差異;設計并合成了Topo-Ⅱα基因特異性的siRNA并轉染U87MG細胞的CSCs,檢測Topo-Ⅱα表達沉默對CSCs的增殖能力、凋亡情況和細胞周期等生物學性狀的影響,進一步了解Topo-Ⅱα在腦膠質瘤發(fā)生機制中的作用。
　　 應用不同類型的Topo-Ⅱα抑制劑HU-331及阿霉素(doxorubicin,Dox)干預U87MG細胞的CSCs及non-CSCs生長,應用MTT法及流式細胞儀觀察細胞增殖情況和細胞凋

5、亡情況;進一步應用Westernblot法檢測Topo-Ⅱα抑制劑對CSCs增殖及細胞凋亡信號傳導通路相關因子(p38MAPK及caspase-3)表達的影響,明確Topo-Ⅱα及其抑制劑對CSCs在腫瘤增殖過程中的作用及影響機制。
　　 結果：
　　 1、人腦膠質母細胞瘤U87MG細胞系的培養(yǎng)及CSCs的分離與鑒定
　　 體外培養(yǎng)U87MG細胞系,并應用含有生長因子(EGF,bFGF)的無血清干細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)1

6、-2周,成功分離出細胞球細胞(neurospherecells,NCs),進一步通過CD133染色證實NCs陽性染色率明顯高于非細胞球細胞(non-sphereformingcells,NSFCs);將NCs打散進行單細胞培養(yǎng)并誘導分化證實其具有多向分化能力;從而證實了NCs具有能分化成GBM并使之呈現細胞多樣性的特點,具備CSCs的特性。
　　 2、Topo-Ⅱα在CSCs和non-CSCs中的表達
　　 應用Real

7、-timePCR和Westernblot法驗證Topo-Ⅱα在CSCs中的表達較non-CSCs中顯著升高(P＜0.05)。
　　 3、特異性siRNA合成及轉染
　　 成功地設計并合成了Topo-Ⅱα基因特異性的siRNA并轉染CSCs,通過Real-timePCR和Westernblot驗證得到了Topo-Ⅱα基因低表達的CSCs模型。結果發(fā)現轉染siRNA-Topo-Ⅱα的細胞增殖能力顯著降低(P＜0.05),細胞

8、明顯阻滯于G0/G1期,細胞凋亡率顯著升高(P＜0.05)。
　　 4、Topo-Ⅱα抑制劑HU-331和Dox對CSCs及non-CSCs增殖的影響
　　 應用Topo-Ⅱα抑制劑HU-331和Dox分別干預CSCs及non-CSCs,觀察細胞的生長增殖情況,發(fā)現兩組細胞都出現了生長停滯且細胞死亡的現象,但經MTT法驗證CSCs組細胞增殖能力較non-CSCs組顯著降低(P＜0.05);HU-331對CSCs和non-

9、CSCs的作用強于Dox的作用,HU-331和Dox抑制CSCs增殖的作用強于對non-CSCs的作用。
　　 5、Topo-Ⅱα抑制劑HU-331和Dox對CSCs及non-CSCs凋亡的影響
　　 應用AnnexinV和PI雙標法通過流式細胞儀分析Topo-Ⅱα抑制劑HU-331和Dox干預后的CSCs及non-CSCs的凋亡情況,并應用Westernblot法檢測細胞凋亡蛋白caspase-3的表達,發(fā)現HU-33

10、1和Dox顯著增加了CSCs和non-CSCs的凋亡率(P＜0.05)并顯著上調caspase-3蛋白的表達(P＜0.05),HU-331的促凋亡作用強于Dox的作用;且HU-331和Dox促進CSCs凋亡的作用強于對non-CSCs的作用。
　　 6、Topo-Ⅱα抑制劑HU-331和Dox對CSCs及non-CSCs中p-p38蛋白表達的影響
　　 應用Westernblot法檢測Topo-Ⅱα抑制劑HU-331和D

11、ox干預后的CSCs及non-CSCs中p-p38蛋白的表達,發(fā)現HU-331和Dox顯著上調了p-p38蛋白的表達(P＜0.05),HU-331上調p-p38蛋白表達的作用強于Dox的作用;且HU-331和Dox對CSCs的作用強于對non-CSCs的作用。
　　 7、p38抑制劑SB203580與Topo-Ⅱα抑制劑HU-331和Dox聯合應用對CSCs凋亡的影響
　　 Topo-Ⅱα抑制劑HU-331和Dox單獨以

12、及分別與p38抑制劑SB203580聯合作用于CSCs,應用Westernblot法檢測細胞凋亡蛋白caspase-3的表達,并應用AnnexinV和PI雙標法通過流式細胞儀分析細胞的凋亡情況,發(fā)現p38抑制劑SB203580能夠顯著下調caspase-3蛋白的表達和細胞凋亡率(P＜0.05),說明p38抑制劑SB203580顯著抑制了HU-331和Dox對CSCs的促凋亡效應。
　　 結論：
　　 1、從人腦膠質母細胞

13、瘤U87細胞系中分離出NCs,并經CD133特異性染色及細胞多向分化能力鑒定其具備CSCs特性。
　　 2、Topo-Ⅱα在CSCs中的表達顯著高于在non-CSCs中的表達。
　　 3、設計并合成的特異性siRNA-Topo-Ⅱα,成功轉染至U87MG細胞系CSCs,獲得了Topo-Ⅱα基因低表達的CSCs模型。
　　 4、RNA干擾Topo-Ⅱα降低CSCs的細胞增殖能力,影響細胞周期變化發(fā)揮促凋亡作用。

14、r>　　 5、Topo-Ⅱα抑制劑HU-331和Dox能夠顯著抑制CSCs和non-CSCs的增殖并促進其凋亡,且HU-331的作用強于Dox的作用;HU-331和Dox對CSCs的作用強于對non-CSCs的作用。
　　 6、Topo-Ⅱα抑制劑HU-331和Dox均能夠通過p38MAPK介導的凋亡分子信號轉導通路影響膠質瘤CSCs及non-CSCs的凋亡,且HU-331的作用強于Dox的作用。P38抑制劑SB203580顯