過表達(dá)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-2基因的INS-1細(xì)胞構(gòu)建研究.pdf

1、研究目的:
　　 慢性胰腺炎患者由于反復(fù)的炎癥刺激,致胰島β細(xì)胞損傷逐漸加重,β細(xì)胞數(shù)目明顯減少,胰島功能顯著下降;同時(shí)長期高糖毒性作用亦可引起胰腺炎的反復(fù)發(fā)作,進(jìn)一步加速胰島β細(xì)胞凋亡,從而最終發(fā)展為繼發(fā)性糖尿病。因此,控制高血糖是慢性胰腺炎后期治療的一個(gè)重要環(huán)節(jié),而目前的治療方法尚存在諸多弊端。傳統(tǒng)的體外胰島素注射治療,由于與胰島素分泌的生理模式不符,易致血糖波動(dòng)而引起相關(guān)并發(fā)癥。細(xì)胞移植治療雖為研究熱點(diǎn),但胰島β細(xì)胞分離與

2、儲(chǔ)存技術(shù)難度較大、代價(jià)昂貴,因此尋找新的移植細(xì)胞來源是該方法亟需解決的關(guān)鍵難題。本課題應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將調(diào)節(jié)胰島素分泌的葡萄糖傳感器--葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-2(glucose transporter-2,GLUT-2)基因轉(zhuǎn)染于INS-1細(xì)胞,使INS-1細(xì)胞的胰島素分泌更接近于生理?xiàng)l件,從而建成新型的“胰島代理細(xì)胞”系,為細(xì)胞移植治療提供新的、易供的移植細(xì)胞來源。
　　 研究背景:
　　 1、INS-1細(xì)胞源于輻射誘導(dǎo)的

3、胰島β細(xì)胞瘤,胰島素含量為8μg/106細(xì)胞,超過80代仍可穩(wěn)定表達(dá),其胰島素含量與原代培養(yǎng)的胰島β細(xì)胞相似,同時(shí)該細(xì)胞自身無分泌胰高血糖素與生長抑素,更有助于在研究中排除其他因素對胰島素分泌的影響。
　　 2、胰島素分泌量與胰島β細(xì)胞內(nèi)的葡萄糖代謝率成正比,故控制葡萄糖流入β細(xì)胞的蛋白或酶類被認(rèn)為是調(diào)節(jié)胰島素釋放的葡萄糖傳感器,葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-2(glucose transporter2,GLUT-2)就是β細(xì)胞內(nèi)的葡萄糖傳感

4、器,其活性直接或間接受葡萄糖濃度調(diào)節(jié),從而改變葡萄糖在胰島β細(xì)胞內(nèi)的代謝速率,進(jìn)而調(diào)節(jié)胰島素的分泌。因此,通過GLUT-2基因轉(zhuǎn)染,可能實(shí)現(xiàn)對胰島素分泌的調(diào)控。
　　 3、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可攜帶靶基因于宿主細(xì)胞內(nèi)長期、穩(wěn)定表達(dá),并且其在一定間隔期內(nèi)多次重復(fù)感染可提高基因轉(zhuǎn)染效率。因而,該載體是構(gòu)建“胰島代理細(xì)胞”最常用的載體系統(tǒng)之一。
　　 第一部分 INS-1細(xì)胞GSIS檢測
　　 目的:對培養(yǎng)的INS-1細(xì)胞進(jìn)

5、行葡萄糖刺激的胰島素分泌(glucose-stimulatedinsulin secretion,GSIS)檢測,從而掌握INS-1細(xì)胞的GSIS特點(diǎn),為其改進(jìn)奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:(1)INS-1細(xì)胞培養(yǎng)于含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中;(2)對INS-1細(xì)胞進(jìn)行GSIS檢測。
　　 結(jié)果:(1)INS-1細(xì)胞在含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中生長良好;(2)GSIS檢測顯示INS-1細(xì)胞存

6、在胰島素分泌,但其胰島素分泌與生理模式存在顯著差異。
　　 結(jié)論:成功培養(yǎng)INS-1細(xì)胞,該細(xì)胞有成熟胰島素的分泌,但其GSIS與生理模式存在顯著差異。
　　 第二部分葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-2基因逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體構(gòu)建/包裝及鑒定
　　 目的:構(gòu)建GLUT-2基因逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體pL-GLUT2-SN,并于PA317細(xì)胞中進(jìn)行包裝,獲取高滴度的穩(wěn)定產(chǎn)毒細(xì)胞克隆PA317/GLUT-2,為GLUT-2基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染INS

7、-1細(xì)胞奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:(1)質(zhì)粒pcB7/GLUT-2以EcoRI,BamH1雙酶切,獲得GLUT-2 cDNA,與同樣酶切的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLXSN在T4DNA連接酶作用下連接,構(gòu)建成重組逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體pL-GLUT2-SN,經(jīng)酶切及測序鑒定;(2)Lipofectamine2000介導(dǎo)pL-GLUT2-SN轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞PA317,分別以PCR、RT-PCR對PA317/GLUT-2細(xì)胞中GLUT-2基因的整合與

8、轉(zhuǎn)錄進(jìn)行檢測。
　　 結(jié)果:(1)構(gòu)建的pL-GLUT2-SN重組載體經(jīng)EcoRI、BamH1雙酶切有1996bp的GLUT-2 cDNA及5.9kb的載體片段,GLUT-2 cDNA序列經(jīng)測序證實(shí)正確;(2)所獲穩(wěn)定產(chǎn)毒細(xì)胞克隆PA317/GLUT-2,其最高病毒滴度可達(dá)7.1×105 CFU/mL;PA317/GLUT-2細(xì)胞RT-PCR擴(kuò)增出158bp的目的片段;而PA317/pLXSN細(xì)胞檢測結(jié)果為陰性,證實(shí)在PA317

9、/GLUT-2細(xì)胞中已獲得GLUT-2基因的轉(zhuǎn)錄。
　　 結(jié)論:所獲GLUT-2 cDNA序列正確,成功構(gòu)建了高滴度的穩(wěn)定產(chǎn)毒細(xì)胞克隆PA317/GLUT-2,為GLUT-2基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染INS-1細(xì)胞奠定了基礎(chǔ)。
　　 第三部分過表達(dá)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-2基因的INS-1細(xì)胞構(gòu)建及GSIS檢測
　　 目的:構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)GLUT2基因的INS-1細(xì)胞,并進(jìn)行GSIS檢測。
　　 方法:(1)以GLUT2病毒感

10、染INS-1細(xì)胞,通過RT-PCR及Western-blot對INS-1/GLUT-2細(xì)胞中GLUT-2基因的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)情況進(jìn)行檢測;(2)對INS-1/GLUT-2細(xì)胞進(jìn)行GSIS檢測。
　　 結(jié)果:(1)所獲INS-1/GLUT-2細(xì)胞經(jīng)RT-PCR檢測顯示有更多的GLUT-2基因轉(zhuǎn)錄;(2)Western-blot證實(shí)INS-1/GLUT-2細(xì)胞中有GLUT-2基因過表達(dá)。(3)GSIS檢測顯示INS-1/GLUT-2細(xì)胞