SATB1通過改變核定位調(diào)控β-類珠蛋白基因表達.pdf

1、細胞核是復雜的有機體，包含各種各樣動態(tài)分布的內(nèi)容物。但是最新的實驗結(jié)果顯示細胞核其實是有序排布的，即使在有絲分裂的間期當染色質(zhì)成疏松伸展狀態(tài)存在時，也并不是想象中那樣散亂分布。SKY技術(shù)利用不同熒光對不同染色體進行標記并將熒光轉(zhuǎn)為光譜進而用精密儀器進行分析。分析結(jié)果顯示不同染色體在細胞核內(nèi)占有特定的空間區(qū)域，稱為染色體區(qū)域。進一步實驗分析還指出長時間沉默的基因以及大量的基因荒漠區(qū)通常位于染色體區(qū)域的內(nèi)部，而活性表達的基因往往分布在染色體

2、區(qū)域的表面，甚至環(huán)出，這與染色體間區(qū)分布有大量基因表達所需的調(diào)控復合物有關，這就是著名的CT-IC模型的基礎理論。因此基因在細胞核內(nèi)的定位就由原來簡單分為異染色質(zhì)區(qū)和常染色質(zhì)區(qū)發(fā)展得更為深入了，基因在細胞核內(nèi)的定位以及位置的變化與基因表達調(diào)控之間的關系也越來越受到重視。除了基因與自己所處的染色體區(qū)域之間的定位關系與基因表達水平有著密切的調(diào)控關系，實驗還發(fā)現(xiàn)，基因與核周邊或核中心區(qū)域的距離也具有基因表達調(diào)控功能。另外核基質(zhì)作為細胞核內(nèi)重要

3、的結(jié)構(gòu)，募集了大量與調(diào)控相關的轉(zhuǎn)錄因子和酶，實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)與核基質(zhì)的結(jié)合狀況也與基因活化狀況相關。因此基因在細胞核內(nèi)不是隨意排布的，定位往往與基因表達狀態(tài)息息相關。 眾所周知數(shù)以萬計的基因并不是任何時間或在任何組織中都表達，組織特異性與發(fā)育階段特異性是基因表達的重要特性，也是維持正常個體發(fā)育和細胞分化并行使正確功能的保障，無論是基因的表達時間還是組織發(fā)生紊亂都會導致細胞功能失常誘發(fā)疾病。既然基因的核定位對基因表達存在調(diào)控作用，那是

4、否基因的核定位也相應地存在組織特異性和發(fā)育階段特異性呢?實驗結(jié)果證實了這種假想?；蛟诤藘?nèi)的定位是隨著基因的活化與抑制而動態(tài)變化的。處于染色質(zhì)內(nèi)部或表面的基因在活化之后會向表面移動或是環(huán)出，而原本環(huán)出的基因則會在表達水平下降之后環(huán)進染色體區(qū)域?；钚员磉_的基因往往會遠離異染色質(zhì)區(qū)域向常染色質(zhì)區(qū)域靠近，而表達受抑制的基因則會向異染色質(zhì)區(qū)域靠近更是早已發(fā)現(xiàn)的現(xiàn)象。基因與核基質(zhì)的結(jié)合其實也是動態(tài)變化的，染色質(zhì)DNA通過許多核基質(zhì)結(jié)合序列與核基質(zhì)

5、結(jié)合，但是并不是所有的這些核基質(zhì)結(jié)合序列都會與核基質(zhì)結(jié)合，而是根據(jù)相鄰的基因表達狀態(tài)有選擇的結(jié)合，而且當基因的表達狀況在受到誘導前后發(fā)生變化后，與核基質(zhì)結(jié)合的核基質(zhì)結(jié)合序列也會發(fā)生變化，這一點也更加證實了核基質(zhì)并不單純是固定染色質(zhì)的核內(nèi)結(jié)構(gòu)，它與基因的表達調(diào)控是密切相關的。 目前對于珠蛋白基因簇在核內(nèi)的定位調(diào)控也有了一些認識，但是并不深入，多是集中在LCR對于β-珠蛋白基因簇核內(nèi)定位的調(diào)控。我們的實驗旨在探索珠蛋白基因簇在核內(nèi)的

6、定位以及該定位與核基質(zhì)的關系。SATB1蛋白是近幾年發(fā)現(xiàn)的T細胞特異性表達的核基質(zhì)結(jié)合蛋白，在其它細胞中少有表達。SATB1蛋白可以相互聚合形成鳥籠樣結(jié)構(gòu)，并且此籠形結(jié)構(gòu)的形成與和核基質(zhì)正確結(jié)合是密切相關的，這不僅為基因表達調(diào)控提供平臺，而且介導了基因與核基質(zhì)的結(jié)合，接受核基質(zhì)上募集的調(diào)控因子的調(diào)控。有實驗發(fā)現(xiàn)在人紅白血病細胞系K562中過表達SATB1蛋白，可以促進β-珠蛋白基因簇的活化，尤其促進胚胎型的基因表達。主要機理是在β-珠蛋

7、白基因簇LCR區(qū)的HS2上以及ε基因的增強子區(qū)域有SATB1蛋白的結(jié)合位點，因此SATB1蛋白募集的一些去乙酰化抑制酶等染色質(zhì)修飾蛋白就可以作用于這兩點的染色質(zhì)使其開放，促進基因表達。由于如前所述，SATB1形成的籠形結(jié)構(gòu)可以募集染色質(zhì)修飾蛋白，而且此作用與核基質(zhì)密切相關，因此我們假設SATB1蛋白對于珠蛋白基因的調(diào)控可能與促使β-珠蛋白基因簇改變核定位有關，而這種核定位的變化有可能與同核基質(zhì)結(jié)合密不可分。 為了證明我們的設想，

8、我們構(gòu)建了SATB1表達載體以及刪除了核基質(zhì)結(jié)合區(qū)的突變SATB1的表達載體，并分別轉(zhuǎn)染K562細胞，獲得穩(wěn)定克隆后進行珠蛋白基因簇的定位分析。首先β-類珠蛋白基因的表達水平檢測發(fā)現(xiàn)，SATB1過表達后可以增加ε基因表達而降低γ基因的表達，這與以前的實驗結(jié)果吻合。而且與我們預期一致的是，在SATB1突變表達后這種調(diào)控結(jié)果減弱了。因此提示SATB1對于珠蛋白基因的表達調(diào)控可能與核基質(zhì)的作用相關。然后，我們利用FISH技術(shù)觀察了SATB1過

9、表達及突變表達的情況下β-珠蛋白基因簇的核內(nèi)定位情況。先以11號染色體區(qū)域為內(nèi)對照觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SATB1過表達后30％的β-珠蛋白基因簇發(fā)生了環(huán)出，與hemin誘導的K562細胞進行的陽性對照中的37％環(huán)出的結(jié)果相接近。但是出乎意料的是，在SATB1突變表達后，同樣有33％的β-珠蛋白基因簇發(fā)生了環(huán)出。根據(jù)兩種情況下珠蛋白基因表達水平的不同以及我們所做的突變分析，這兩種情況下的核定位應該是有區(qū)別的。于是我們又以核基質(zhì)進行內(nèi)對照，對β-

10、珠蛋白基因簇的核定位進行觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在SATB1過表達時，大部分β-珠蛋白基因簇是與核基質(zhì)結(jié)合的，而當SATB1突變表達之后，雖然β-珠蛋白基因簇發(fā)生了環(huán)出，但是并不與核基質(zhì)結(jié)合，而是處于核暈的部位。這與以往的實驗發(fā)現(xiàn)用紅系不表達的IgG基因簇上的LCR替代β-珠蛋白基因簇原位的LCR之后雖然促使了珠蛋白基因簇的環(huán)出，但是并不能轉(zhuǎn)位使其遠離異染色質(zhì)區(qū)也不能促進珠蛋白基因的表達有相似之處。因此提示，β-珠蛋白基因簇的環(huán)出是調(diào)控珠蛋白基

11、因表達的必要非充分條件，環(huán)出之后的具體定位也起重要作用。 另外由于核基質(zhì)有多種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子結(jié)合，那么與核基質(zhì)的不同結(jié)合狀態(tài)是否會改變β-珠蛋白基因簇與重要反式因子的結(jié)合狀況?我們利用ChIP技術(shù)觀察β-珠蛋白基因簇與PolⅡ與GATA1的結(jié)合狀態(tài)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SATB1過表達后增加了HS2區(qū)域和￡基因的啟動子區(qū)與PolⅡ的結(jié)合幾率，同時降低了丫基因的啟動子區(qū)與PolⅡ的結(jié)合幾率。而在SATB1突變表達的情況下，三個觀察點上的Pol

12、Ⅱ結(jié)合幾率與正常K562細胞對照沒有明顯差別。關于GATA1，實驗發(fā)現(xiàn)SATB1過表達后增加了HS2區(qū)域和GATA1的結(jié)合幾率，但是降低了ε基因和γ基因GATA1結(jié)合位點的結(jié)合幾率；而在SATB1突變表達的情況下，HS2區(qū)域和GATA1的結(jié)合幾率降低了，ε基因與GATA1的結(jié)合幾率沒有明顯規(guī)律，而γ基因的結(jié)合情況與正常對照沒有差別.此結(jié)果與半定量PCR發(fā)現(xiàn)的正常SATB1蛋白促進胚胎期珠蛋白基因表達而降低胎兒期珠蛋白基因表達，突變SAT

13、B1蛋白不具有此調(diào)控效果的結(jié)果相一致，也提示SATB1蛋白可能通過介導β-珠蛋白基因簇與核基質(zhì)的結(jié)合，改變與調(diào)控因子的結(jié)合狀態(tài)從而調(diào)控珠蛋白基因表達。 基于我們的研究，我們提出關于SATB1調(diào)控β-珠蛋白基因簇機制模型的假想：SATB1蛋白相互聚合形成籠形結(jié)構(gòu)，在聚合過程中促使與之結(jié)合的β-珠蛋白基因簇環(huán)出11號染色體區(qū)域，并且介導β-珠蛋白基因簇與核基質(zhì)的結(jié)合。并且由于SATB1蛋白的結(jié)合位點主要是在HS2區(qū)域和ε基因的近端調(diào)