MicroRNA-134通過(guò)調(diào)控TAB1的表達(dá)抑制肝星狀細(xì)胞活化.pdf

1、研究目的:
　　肝纖維化是肝臟對(duì)各種慢性損傷的病理性修復(fù)反應(yīng)，以肝星狀細(xì)胞(Hepatic stellate cells,HSC)活化、細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)過(guò)度沉積為主要特征。肝纖維化是病毒性、自身免疫性、酒精性、非酒精性脂肪性以及銅鐵代謝異常等病因?qū)е碌穆愿螕p傷發(fā)展為肝硬化的必經(jīng)過(guò)程[1，2]，但這一過(guò)程是可逆的。因此，肝纖維化的治療具有重要的意義。
　　微小RNA(microR

2、NA，miRNA)是一類長(zhǎng)約15-22個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA，其主要通過(guò)結(jié)合靶向信使RNA(mRNA)的3'非編碼區(qū)（3'-untranslated region3'UTR），直接降解mRNA或抑制其轉(zhuǎn)錄來(lái)調(diào)節(jié)基因的表達(dá)[3，4]。研究表明人體中約有1880種miRNAs[5]，且三分之一的mRNA受到miRNA的調(diào)控[6][1]，因此miRNA參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、代謝及內(nèi)分泌等多種功能的調(diào)節(jié)[7-10][2]。Micro

3、RNA的表達(dá)異常與腫瘤形成、心臟衰竭、神經(jīng)再生等多種疾病相關(guān)[11-13]。大量研究發(fā)現(xiàn)體內(nèi)多種器官（心臟、腎臟、肺、肝臟）的纖維化伴隨著miRNA的表達(dá)異常。在肝纖維化中，許多miRNA可通過(guò)影響HSC增殖活化、細(xì)胞外基質(zhì)合成以及肝纖維化相關(guān)信號(hào)通路等多個(gè)環(huán)節(jié)調(diào)控肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。因此，miRNA可能成為診斷和治療肝纖維化的重要靶點(diǎn)。
　　MicroRNA-134位于人14號(hào)染色體印記基因Dlk1/Dio3區(qū)域上hsa-miR

4、-379～hsa-miR-656miRNA簇，首先被發(fā)現(xiàn)為腦特異miRNA[14]，能夠參與突觸細(xì)微結(jié)構(gòu)的調(diào)控，并促進(jìn)樹(shù)突生長(zhǎng)和脊髓形成[15]。研究發(fā)現(xiàn)miR-134與神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤關(guān)系密切，能夠通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯、靶向干細(xì)胞相關(guān)基因Nanog等，參與調(diào)控腫瘤干細(xì)胞分化，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[16]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究證實(shí)，MicroRNA-134通過(guò)靶向調(diào)控KRAS抑制肝癌細(xì)胞增殖、克隆形成和轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為，且肝癌組織

5、中miR-134表達(dá)水平與肝癌臨床惡性表型存在密切關(guān)聯(lián)[17]。晚近數(shù)據(jù)顯示miR-134與特發(fā)性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）關(guān)系密切，相比健康人群，IPF患者miR-134表達(dá)顯著下調(diào)[18]。miR-134在非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lung carcinoma，NSCLC)中可抑制TGF-3誘導(dǎo)的上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)型(Epithelial-to-mesenchymal

6、 transition EMT)過(guò)程[19]。Liu Y等在腎細(xì)胞癌中也證實(shí)了miR-134可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖及EMT過(guò)程[20]。而Sangyoon Lee等近期研究發(fā)現(xiàn)miR-134介導(dǎo)昆布(Dieckol)的抗肝纖維化作用[21]。以上研究表明miR-134參與了多種器官的纖維化進(jìn)程，但miR-134在肝纖維化發(fā)生、發(fā)展中的作用及其機(jī)制尚不明確。
　　基于以上研究，本課題擬研究miR-134在肝纖維化發(fā)生發(fā)展的作用及其機(jī)制

7、，為肝纖維化的治療提供新的思路。
　　研究方法：
　　一、MicroRNA-134的表達(dá)情況與肝纖維化的關(guān)系
　　1.從中國(guó)科學(xué)院上海動(dòng)物中心購(gòu)買(mǎi)Sprague-Dawley(SD)大鼠8只，重約180-200g，隨機(jī)分為兩組:對(duì)照組和模型組，每組各4只。對(duì)照組按照每公斤體重一毫升生理鹽水給予腹腔注射，每周2次，共8周;模型組按照每公斤體重一毫升50％CCl4/橄欖油混合液腹腔注射，每周2次，共8周，構(gòu)建大鼠肝纖維化模

8、型。于第8周末麻醉、處死所有大鼠。肝組織石蠟包埋、切片后用蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin，H&E)、天狼星紅-飽和苦味酸染色(Sirius red)進(jìn)行組織化學(xué)染色評(píng)價(jià)肝纖維化程度，并用相關(guān)軟件Image-Pro Plus進(jìn)行纖維化半定量分析。Real time RT-PCR檢測(cè)miR-134及肝纖維化相關(guān)基因α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、Ⅰ型膠原蛋白(Collage

9、n typeⅠ，COLⅠ)的mRNA表達(dá)水平。Western blot檢測(cè)肝纖維化相關(guān)基因α-SMA、COLⅠ的蛋白表達(dá)水平。
　　2.HSC活化過(guò)程中miR-134表達(dá)變化
　　利用不同濃度TGF-β(0ng/ml、2ng/ml、4ng/ml)處理人HSC-LX224h后，利用Real time RT-PCR技術(shù)檢測(cè)miR-134及α-SMA、COLⅠ的表達(dá)水平。
　　二、MicroRNA-134對(duì)HSC的增殖及活化

10、的影響
　　1.MicroRNA-134對(duì)HSC增殖能力影響
　　接種HSC-LX2至96孔板，每孔3000個(gè)細(xì)胞，24h后轉(zhuǎn)染對(duì)照NC和miR-134模擬物(mimic)上調(diào)人HSC-LX2中miR-134表達(dá)。通過(guò)CCK8方法檢測(cè)上調(diào)miR-134對(duì)HSC增殖能力影響。
　　接種HSC-LX2至96孔板，每孔3000個(gè)細(xì)胞，24h后轉(zhuǎn)染對(duì)照和miR-134抑制劑(inhibitor)下調(diào)人HSC-LX2中miR-1

11、34表達(dá)。通過(guò)CCK8方法檢測(cè)下調(diào)miR-134對(duì)HSC增殖能力影響。
　　2.MicroRNA-134對(duì)HSC活化的影響
　　轉(zhuǎn)染miR-134mimic上調(diào)HSC-LX2中miR-134或轉(zhuǎn)染miR-134inhibitor下調(diào)miR-134后，分別收集RNA和蛋白，分別利用Real time RT-PCR和western blot檢測(cè)HSC-LX2α-SMA、COLⅠ在mRNA和蛋白水平表達(dá)變化情況。
　　三、M

12、icroRNA-134抑制HSC增殖及活化的機(jī)制研究
　　1.利用電腦軟件target Scan預(yù)測(cè)miR-134的靶基因，查閱文獻(xiàn)，選擇與肝纖維化相關(guān)的靶基因-轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子激酶1(transforming growth factor-beta-actived kinase1，TAK1)結(jié)合蛋白1(TAK1binding protein1，TAB1)進(jìn)行驗(yàn)證。
　　2.轉(zhuǎn)染miR-134mimic上調(diào)HSC-LX2中miR-

13、134的表達(dá)或轉(zhuǎn)染miR-134inhibitor下調(diào)miR-134表達(dá)，通過(guò)Real time RT-PCR和western blot檢測(cè)預(yù)測(cè)靶基因TAB1mRNA和蛋白水平變化。
　　3.根據(jù)軟件預(yù)測(cè)的miR-134與TAB13'UTR的結(jié)合位點(diǎn)構(gòu)建熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，檢測(cè)miR-134對(duì)該螢光素酶報(bào)告基因作用。將miR-134在TAB13'UTR上的結(jié)合位點(diǎn)突變后，檢測(cè)miR-134對(duì)突變后的熒光酶報(bào)告基因的作用，以明確T

14、AB1是否為miR-134的直接靶基因。
　　4.明確TAB1是否介導(dǎo)miR-134對(duì)HSC的作用
　　利用化學(xué)合成的TAB1siRNA下調(diào)HSC-LX2中TAB1的表達(dá)后，通過(guò)CCK8方法檢測(cè)HSC增殖能力變化。通過(guò)Real time RT-PCR和western blot檢測(cè)α-SMA、COLⅠ的表達(dá)變化，共轉(zhuǎn)染miR-134inhibitor和TAB1siRNA后，通過(guò)CCK8方法HSC增殖能力變化和western b

15、lot檢測(cè)α-SMA、COLⅠ的表達(dá)變化，證實(shí)TAB1是否介導(dǎo)miR-134對(duì)HSC的抑制作用。
　　四、上調(diào)miR-134對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠肝纖維化的影響
　　雄性SD大鼠24只，重180-200g，將大鼠隨機(jī)分為2組:對(duì)照組（12只）按5×109pfu/只尾靜脈注射AdGFP病毒，2次/周;AdmiR-134治療組（12只）按5×109pfu/只尾靜脈注射Ad-134病毒，2次/周，共7周。注射病毒1周后，兩組均給予50％CC

16、l4/橄欖油1ml/Kg體重腹腔注射，2次/周，共6周，于第6周末處死所有大鼠。進(jìn)行肝組織H&E、Sirius red化學(xué)染色評(píng)價(jià)肝纖維化程度，利用Real time RT-PCR檢測(cè)miR-134及α-SMA、COLⅠ的表達(dá)變化。
　　五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)分析，方差齊性兩樣本資料采用兩樣本雙尾T檢驗(yàn)方法進(jìn)行分析;P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.01為具有非常顯著性差異。

17、r>　　研究結(jié)果：
　　一、MicroRNA-134表達(dá)下調(diào)與肝纖維化的進(jìn)展相關(guān)
　　1.H&E染色發(fā)現(xiàn)，相比正常組，模型組肝組織中肝小葉結(jié)構(gòu)破壞、脂肪變性明顯，大量纖維間隔形成。天狼星紅-飽和苦味酸染色顯示造模后肝組織大量纖維疤痕形成。Real time RT-PCR和Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照相比，纖維化相關(guān)基因α-SMA、COLⅠmRNA及蛋白表達(dá)均上調(diào)。上述結(jié)果提示:CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化模型構(gòu)建成

18、功，且肝纖維化后肝組織中miR-134表達(dá)水平較正常肝臟明顯下調(diào)。
　　2.HSC活化過(guò)程中miR-134表達(dá)下調(diào)
　　用TGF-β活化HSC-LX2細(xì)胞后，Real time RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)α-SMA、COLⅠ表達(dá)顯著上調(diào)，miR-134表達(dá)則顯著下調(diào)。
　　二、MicroRNA-134抑制HSC的增殖及活化
　　1.MicroRNA-134抑制HSC增殖
　　轉(zhuǎn)染miR-134mimic上調(diào)HSC

19、-LX2細(xì)胞中miR-134的表達(dá)后，通過(guò)CCK8檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-134可顯著抑制HSC增殖能力。
　　轉(zhuǎn)染miR-134inhibitor下調(diào)HSC-LX2細(xì)胞中miR-134的表達(dá)后，通過(guò)CCK8檢測(cè)發(fā)現(xiàn)下調(diào)miR-134可促進(jìn)HSC增殖能力。
　　2.MieroRNA-134抑制HSC的活化
　　轉(zhuǎn)染miR-134mimic上調(diào)HSC-LX2中miR-134的表達(dá)后，α-SMA、COLⅠ在mRNA和蛋白水平均明顯

20、下降，而轉(zhuǎn)染miR-134inhibitor下調(diào)HSC-LX2中miR-134的表達(dá)后，α-SMA、COLⅠ表達(dá)均升高。
　　三、TAB1是miRNA-134的直接靶基因
　　1.Target Scan軟件預(yù)測(cè)結(jié)果顯示TAB13'UTR上含有miR-134的作用位點(diǎn)。上調(diào)HSC-LX2細(xì)胞中miR-134表達(dá)后，TAB1mRNA和蛋白表達(dá)顯著降低;下調(diào)HSC-LX2細(xì)胞中miR-134表達(dá)后，TAB1mRNA和蛋白表達(dá)顯著升

21、高。
　　2.上調(diào)miR-134表達(dá)可顯著抑制TAB13'UTR熒光素酶報(bào)告基因活性。將TAB13'UTR上的miR-134結(jié)合位點(diǎn)突變后，miR-134對(duì)此報(bào)告基因的活性無(wú)明顯影響，表明TAB1為miR-134的直接靶基因。
　　3.下調(diào)HSC-LX2細(xì)胞中TAB1表達(dá)可顯著抑制HSC的增殖和活化，與miR-134mimic效應(yīng)相似，轉(zhuǎn)染miR-134inhibitor下調(diào)miR-134后促進(jìn)HSC-LX2細(xì)胞增殖及活化，

22、而共轉(zhuǎn)染miR-134inhibitor和TAB1siRNA后，此促進(jìn)作用減弱，表明TAB1可能部分介導(dǎo)miR-134對(duì)HSC細(xì)胞增殖及活化的抑制作用。
　　四、上調(diào)miRNA-134抑制實(shí)驗(yàn)性大鼠肝纖維化進(jìn)程
　　H&E染色發(fā)現(xiàn)，相比AdGFP組，AdmiR-134治療組肝組織中肝小葉結(jié)構(gòu)基本正常、脂肪變性較少。天狼星紅-飽和苦味酸染色顯示AdmiR-134治療組肝膠原沉積明顯減少;Real time RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)

23、AdmiR-134治療組α-SMA、COLⅠmRNA及表達(dá)下調(diào)。上述結(jié)果提示:上調(diào)miR-134抑制實(shí)驗(yàn)性大鼠肝纖維化進(jìn)程
　　研究結(jié)論：
　　1.MicroRNA-134表達(dá)下調(diào)與肝纖維化的進(jìn)展相關(guān);
　　2.MicroRNA-134可抑制HSC的增殖及活化;
　　3.MicroRNA-134通過(guò)調(diào)控其直接靶基因TAB1的表達(dá)抑制HSC增殖及活化;
　　4.上調(diào)miRNA-134抑制實(shí)驗(yàn)性大鼠肝纖維化進(jìn)程