1，25(OH)2D3通過調(diào)節(jié)miRNA表達抑制大鼠肝星狀細胞活化機制的研究.pdf

1、目的:
　　肝纖維化是各種肝病發(fā)展至肝硬化甚至肝細胞癌的共同的病理過程。目前研究表明，肝纖維化是一個高度動態(tài)發(fā)展的過程，有效的干預(yù)措施可延緩甚至逆轉(zhuǎn)肝纖維化的發(fā)生發(fā)展，因此尋找有效的藥物或治療靶點來逆轉(zhuǎn)肝纖維化過程就顯得尤為重要。1，25(OH)2D3是維生素D在體內(nèi)的活性形式，團隊在前期的實驗發(fā)現(xiàn)其具有抑制大鼠肝星狀細胞增殖、促進其凋亡的作用，具有抗肝纖維化作用，但具體的作用機制尚不明確。miRNA是一類長度大約為18-25nt

2、的單鏈非編碼RNA，參與調(diào)控其他蛋白質(zhì)編碼基因的表達，研究發(fā)現(xiàn)很多的miRNA參與HSC激活、增殖，從而促進或抑制肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。本研究目的是探索1，25(OH)2D3是否通過調(diào)節(jié)miRNA表達抑制大鼠肝星狀細胞活化或通過調(diào)節(jié)miRNA介導(dǎo)的信號通路，從而發(fā)揮抗肝纖維化作用。
　　方法:
　　通過皮下注射CCL4和10pmmol/L TGF-β1刺激肝星狀細胞分別構(gòu)建體內(nèi)和體外肝纖維化模型。轉(zhuǎn)染miRNA mimics/

3、inhibit在肝星狀細胞過表達/抑制miRNA。1，25(OH)2D3分別作用于肝星狀細胞和SD大鼠。通過qPCR篩選出差異表達的miRNA、驗證轉(zhuǎn)染是否成功及各組肝星狀細胞中差異表達的miRNA表達量;通過CCK8檢測肝星狀細胞的增殖;通過流式細胞術(shù)檢測肝星狀細胞的凋亡;通過檢測SD大鼠血清ALT及AST含量、HE染色的方法檢測大鼠組織肝纖維化程度;采用生物信息學(xué)技術(shù)分析miRNA靶基因;Western blot法進行靶基因的驗證。

4、
　　結(jié)果:
　　1.與原代肝星狀細胞相比，活化后的肝星狀細胞中miR-146a、miR-30c、miR-193、miR-101、miR-200a表達均有異常，但其中以miR-146a變化具有統(tǒng)計學(xué)意義;
　　2.miR-146a mimics轉(zhuǎn)染組大鼠肝星狀細胞增殖率較miR-146a mimics NC組明顯減少，miR-146a inhibit組增殖率較miR-146a inhibit NC組明顯增加，1，25(

5、OH)2D3組肝星狀細胞增殖率較DMSO對照組明顯減少;miR-146a mimics轉(zhuǎn)染組大鼠肝星狀細胞凋亡率較miR-146a mimics NC組明顯增加，miR-146ainhibit組凋亡率較miR-146a inhibit NC組明顯減少，1，25(OH)2D3組肝星狀細胞凋亡率較DMSO組明顯增加，(P＜0.05)，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義;
　　3.模型組和藥物對照組中大鼠血清中ALT、AST表達量較正常組明顯增加，藥

6、物治療組中ALT、AST表達較藥物對照組中明顯降低(P＜0.05)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義;
　　4.HE染色顯示模型組和藥物對照組中大鼠肝肝組織肝纖維化程度明顯，而藥物治療組中大鼠肝纖維化程度較藥物對照組明顯減輕。
　　5.模型組和藥物對照組大鼠肝組織中miR-146a表達量較正常組明顯下調(diào)(P＜0.05)，而藥物治療組大鼠肝組織中miR-146a表達量較藥物對照組明顯上調(diào)(P＜0.05)，以上差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義;
　

7、　6.生物技術(shù)分析顯示DLL1為miR-146a潛在的靶基因，DLL1在模型組及藥物對照組表達量較正常組明顯增加(P＜0.05)，而在藥物治療組中表達量較藥物對照組明顯減少(P＜0.05)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義;
　　結(jié)論:
　　1.miR-146a在TGF-β1刺激的肝星狀細胞和SD大鼠肝纖維化模型中表達是下調(diào)的。
　　2.1，25(OH)2D3具有抑制大鼠肝纖維化形成和抑制大鼠HSC活化的作用。
　　3.1，2