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文檔簡介
1、目的:
肝纖維化是各種肝病發(fā)展至肝硬化甚至肝細胞癌的共同的病理過程。目前研究表明,肝纖維化是一個高度動態(tài)發(fā)展的過程,有效的干預(yù)措施可延緩甚至逆轉(zhuǎn)肝纖維化的發(fā)生發(fā)展,因此尋找有效的藥物或治療靶點來逆轉(zhuǎn)肝纖維化過程就顯得尤為重要。1,25(OH)2D3是維生素D在體內(nèi)的活性形式,團隊在前期的實驗發(fā)現(xiàn)其具有抑制大鼠肝星狀細胞增殖、促進其凋亡的作用,具有抗肝纖維化作用,但具體的作用機制尚不明確。miRNA是一類長度大約為18-25nt
2、的單鏈非編碼RNA,參與調(diào)控其他蛋白質(zhì)編碼基因的表達,研究發(fā)現(xiàn)很多的miRNA參與HSC激活、增殖,從而促進或抑制肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。本研究目的是探索1,25(OH)2D3是否通過調(diào)節(jié)miRNA表達抑制大鼠肝星狀細胞活化或通過調(diào)節(jié)miRNA介導(dǎo)的信號通路,從而發(fā)揮抗肝纖維化作用。
方法:
通過皮下注射CCL4和10pmmol/L TGF-β1刺激肝星狀細胞分別構(gòu)建體內(nèi)和體外肝纖維化模型。轉(zhuǎn)染miRNA mimics/
3、inhibit在肝星狀細胞過表達/抑制miRNA。1,25(OH)2D3分別作用于肝星狀細胞和SD大鼠。通過qPCR篩選出差異表達的miRNA、驗證轉(zhuǎn)染是否成功及各組肝星狀細胞中差異表達的miRNA表達量;通過CCK8檢測肝星狀細胞的增殖;通過流式細胞術(shù)檢測肝星狀細胞的凋亡;通過檢測SD大鼠血清ALT及AST含量、HE染色的方法檢測大鼠組織肝纖維化程度;采用生物信息學(xué)技術(shù)分析miRNA靶基因;Western blot法進行靶基因的驗證。
4、
結(jié)果:
1.與原代肝星狀細胞相比,活化后的肝星狀細胞中miR-146a、miR-30c、miR-193、miR-101、miR-200a表達均有異常,但其中以miR-146a變化具有統(tǒng)計學(xué)意義;
2.miR-146a mimics轉(zhuǎn)染組大鼠肝星狀細胞增殖率較miR-146a mimics NC組明顯減少,miR-146a inhibit組增殖率較miR-146a inhibit NC組明顯增加,1,25(
5、OH)2D3組肝星狀細胞增殖率較DMSO對照組明顯減少;miR-146a mimics轉(zhuǎn)染組大鼠肝星狀細胞凋亡率較miR-146a mimics NC組明顯增加,miR-146ainhibit組凋亡率較miR-146a inhibit NC組明顯減少,1,25(OH)2D3組肝星狀細胞凋亡率較DMSO組明顯增加,(P<0.05),差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義;
3.模型組和藥物對照組中大鼠血清中ALT、AST表達量較正常組明顯增加,藥
6、物治療組中ALT、AST表達較藥物對照組中明顯降低(P<0.05),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義;
4.HE染色顯示模型組和藥物對照組中大鼠肝肝組織肝纖維化程度明顯,而藥物治療組中大鼠肝纖維化程度較藥物對照組明顯減輕。
5.模型組和藥物對照組大鼠肝組織中miR-146a表達量較正常組明顯下調(diào)(P<0.05),而藥物治療組大鼠肝組織中miR-146a表達量較藥物對照組明顯上調(diào)(P<0.05),以上差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義;
7、 6.生物技術(shù)分析顯示DLL1為miR-146a潛在的靶基因,DLL1在模型組及藥物對照組表達量較正常組明顯增加(P<0.05),而在藥物治療組中表達量較藥物對照組明顯減少(P<0.05),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義;
結(jié)論:
1.miR-146a在TGF-β1刺激的肝星狀細胞和SD大鼠肝纖維化模型中表達是下調(diào)的。
2.1,25(OH)2D3具有抑制大鼠肝纖維化形成和抑制大鼠HSC活化的作用。
3.1,2
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