抗癲癇藥物對(duì)癲癇幼鼠認(rèn)知的影響及其機(jī)制的研究.pdf

1、研究背景：
　　 癲癇是臨床常見(jiàn)的慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，以生后第一年發(fā)病率最高，部分患兒還伴有認(rèn)知功能的損害，不僅危害了身心健康，還降低了整個(gè)家庭的生活質(zhì)量。與癲癇相關(guān)的認(rèn)知障礙一直是醫(yī)生及家長(zhǎng)非常關(guān)注的問(wèn)題。癲癇患兒伴發(fā)的認(rèn)知障礙與發(fā)病原因、起病年齡、病灶部位、發(fā)作類型、持續(xù)時(shí)間、發(fā)作頻率及抗癲癇藥物等多種因素均有關(guān)，但由于抗癲癇藥物是可觸及、可選擇因素，且為目前治療癲癇最主要方法而受到更多的關(guān)注。傳統(tǒng)抗癲癇藥物對(duì)認(rèn)知功能的影響已

2、有大量研究報(bào)道，發(fā)現(xiàn)對(duì)認(rèn)知的多個(gè)方面包括空間學(xué)習(xí)記憶，運(yùn)動(dòng)水平，注意力甚至情緒等均可產(chǎn)生不良影響。雖然有一些研究顯示新型抗癲癇藥物較傳統(tǒng)抗癲癇藥物對(duì)認(rèn)知功能的影響小，但研究并不充分，對(duì)發(fā)育期大腦影響的報(bào)道較少見(jiàn)，對(duì)托吡酯等藥物到底是利是弊也存有爭(zhēng)議。因此本研究中的抗癲癇藥物既有存在爭(zhēng)論的托吡酯(TPM)，也有近年臨床普遍應(yīng)用的其它新型抗癲癇藥左乙拉西坦(LEV)、拉莫三嗪(LTG)和奧卡西平(OXC)，還包括目前仍廣泛應(yīng)用的傳統(tǒng)抗癲癇藥

3、丙戊酸鈉(VPA)，通過(guò)不同的測(cè)試方法評(píng)價(jià)這些藥物對(duì)幼鼠空間學(xué)習(xí)記憶、工作記憶及活動(dòng)水平的影響。
　　 抗癲癇藥物對(duì)認(rèn)知影響的具體機(jī)制至今尚不明了，使得臨床上醫(yī)生對(duì)于防治抗癲癇藥物對(duì)認(rèn)知的副作用無(wú)的放矢。以往已經(jīng)進(jìn)行了一些關(guān)于抗癲癇藥物對(duì)大腦功能損害的研究，大多局限于對(duì)大腦細(xì)胞凋亡的影響，但是對(duì)其他可能的機(jī)制如對(duì)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、神經(jīng)元前體細(xì)胞增殖和遷移影響的研究很少，對(duì)突觸結(jié)構(gòu)及功能可塑性等方面的研究更是罕見(jiàn)，而這些也有可能是造成

4、生前或生后接觸抗癲癇藥引起認(rèn)知損害的重要原因，有必要對(duì)這些機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步的研究。
　　 目前的癲癇動(dòng)物實(shí)驗(yàn)多使大鼠經(jīng)歷單次癇性發(fā)作持續(xù)狀態(tài)，而臨床上的癲癇患兒常有反復(fù)發(fā)作而非單次的長(zhǎng)時(shí)程驚厥。數(shù)項(xiàng)研究也顯示在未成熟動(dòng)物中，單次的長(zhǎng)時(shí)發(fā)作極少導(dǎo)致細(xì)胞喪失及發(fā)芽，也極少有學(xué)習(xí)記憶及行為缺陷，因此本實(shí)驗(yàn)以經(jīng)歷3次匹羅卡品誘發(fā)癲癇發(fā)作的新生期幼鼠為模型，并與正常大鼠進(jìn)行對(duì)照研究，在模擬臨床的同時(shí)觀察抗癲癇藥物是否對(duì)正常大鼠和癲癇大鼠有不

5、同的影響。此前的實(shí)驗(yàn)多集中于成年期，對(duì)于發(fā)育期大腦的研究并不多，而小兒尤其是新生兒的神經(jīng)生理及解剖與成人有很大不同，如突觸產(chǎn)生及發(fā)育尚未完成，未成熟海馬和皮層神經(jīng)元對(duì)驚厥活動(dòng)更易感，電驚厥傳播異常，黑質(zhì)驚厥抑制系統(tǒng)發(fā)育不足等，從而推測(cè)發(fā)育期的腦對(duì)抗癲癇藥物的反應(yīng)可能與成年期不同，之前也有研究顯示抗癲癇藥物對(duì)幼年動(dòng)物認(rèn)知功能的損傷大于成年動(dòng)物。因此非常有必要深入研究長(zhǎng)期應(yīng)用抗癲癇藥對(duì)發(fā)育期大腦認(rèn)知功能的影響及其機(jī)制，對(duì)臨床藥物選擇提供理論

6、依據(jù)，實(shí)現(xiàn)有效控制癲癇發(fā)作同時(shí)降低對(duì)認(rèn)知的影響。
　　 目的：
　　 研究長(zhǎng)期應(yīng)用抗癲癇藥物對(duì)癲癇幼鼠的空間學(xué)習(xí)記憶、工作記憶、活動(dòng)水平以及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、神經(jīng)發(fā)生、苔蘚纖維發(fā)芽、突觸可塑性相關(guān)蛋白的影響，探討抗癲癇藥物對(duì)發(fā)育期大腦認(rèn)知功能的影響及其機(jī)制。
　　 方法：
　　 1.造模、分組及投藥:
　　 選用出生后1d(P1)的雄性Wistar大鼠，隨機(jī)分為癲癇組及對(duì)照組，癲癇組大鼠分別在生后1d

7、，4d及7d予腹腔注射匹羅卡品誘發(fā)癲癇發(fā)作。對(duì)照組大鼠腹腔注射同等量生理鹽水。將生后8d的存活的癲癇組大鼠隨機(jī)分為生理鹽水對(duì)照組(EP+NS)、VPA治療組(EP+VPA)、LEV治療組(EP+LEV)、OXC治療組(EP+OXC)、TPM治療組(EP+TPM)、LTG治療組(EP+LTG);對(duì)照組大鼠隨機(jī)分為生理鹽水對(duì)照組(CON+NS)、應(yīng)用VPA組(CON+VPA)、應(yīng)用LEV組(CON+LEV)、應(yīng)用OXC組(CON+OXC)、

8、應(yīng)用TPM組(CON+TPM)、應(yīng)用LTG組(CON+LTG)。自生后8d，各藥物干預(yù)組大鼠分別接受以下藥物每日灌胃1次:VPA200mg/kg、LEV100mg/kg、TPM40mg/kg、OXC100mg/kg、LTG40mg/kg。生理鹽水對(duì)照組每日接受生理鹽水灌胃。連續(xù)用藥3周。
　　 2.研究長(zhǎng)期應(yīng)用抗癲癇藥物對(duì)幼鼠認(rèn)知的影響:
　　 所有大鼠于P29-P30進(jìn)行曠場(chǎng)測(cè)試以評(píng)價(jià)其活動(dòng)水平，P31-P36時(shí)進(jìn)行M

9、orris水迷宮測(cè)試評(píng)價(jià)其視覺(jué)—空間學(xué)習(xí)和記憶能力，P37P-38進(jìn)行改良的Y迷宮以評(píng)價(jià)其工作記憶。
　　 3.研究長(zhǎng)期應(yīng)用抗癲癇藥物對(duì)發(fā)育期大腦神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、神經(jīng)發(fā)生、苔蘚纖維發(fā)芽及突觸可塑性相關(guān)蛋白的影響:
　　 用藥3周后，每組大鼠取6只斷頭取腦，測(cè)量腦重，用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)和突觸小體相關(guān)蛋白（SNAP-25）mRNA的表達(dá)，Westernblot檢測(cè)BDNF、SNAP-25蛋白的表

10、達(dá)。每組剩余的大鼠過(guò)量麻醉后分別灌注固定取腦行BrdU染色與Timm染色觀察海馬神經(jīng)發(fā)生與苔蘚纖維發(fā)芽。
　　 結(jié)果：
　　 1.長(zhǎng)期應(yīng)用抗癲癇藥物對(duì)幼鼠認(rèn)知的影響:
　　 (1)體重增長(zhǎng):VPA處理組大鼠用藥4天后出現(xiàn)體重增長(zhǎng)加快(P＜0.05)，LTG處理大鼠用藥1周后體重增張減慢(P＜0.05)。TPM、LEV及OXC處理組大鼠體重增長(zhǎng)與相應(yīng)對(duì)照組無(wú)差異（P＞0.05）。
　　 (2)曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn):EP

11、+NS組大鼠在固定時(shí)間內(nèi)穿越的方格數(shù)明顯低于CON+NS組大鼠（P＜0.01）。LEV處理組大鼠穿越的方格數(shù)較相應(yīng)對(duì)照組增多（P＜0.05)。LTG處理組大鼠穿越的方格數(shù)較相應(yīng)對(duì)照組減少（P＜0.05)。VPA、TPM及OXC處理大鼠穿越的方格數(shù)與相應(yīng)鹽水對(duì)照組無(wú)差異（P＞0.05）。
　　 (3)Morris水迷宮:EP+NS組大鼠較CON+NS組找到水下平臺(tái)的時(shí)間明顯延長(zhǎng)，穿越原平臺(tái)位置次數(shù)減少，在目的象限停留時(shí)間縮短（P＜

12、0.05)。VPA處理組及CON+TPM組大鼠也較各自對(duì)照組找到平臺(tái)的時(shí)間延長(zhǎng)，穿越原平臺(tái)位置的次數(shù)減少，在目的象限停留時(shí)間縮短(P＜0.05);EP+LEV組大鼠搜尋平臺(tái)的潛伏期縮短，穿越原平臺(tái)位置的次數(shù)增加，在目的象限停留時(shí)間延長(zhǎng)(P＜0.05)。其余各組大鼠的成績(jī)與相應(yīng)對(duì)照組無(wú)差異(P＞0.05)
　　 (4)改良的Y迷宮:EP+NS組大鼠每天第一輪與第二輪測(cè)試中，每輪的后10次嘗試，與前10次相比，錯(cuò)誤次數(shù)無(wú)明顯變化（P

13、＞0.05），無(wú)論是訓(xùn)練階段還是保持階段，總錯(cuò)誤次數(shù)均高于CON+NS組大鼠(P＜0.05)。EP+LEV組大鼠成績(jī)優(yōu)于EP+NS組，每日兩輪測(cè)試中，每輪的后10次嘗試與前10次相比錯(cuò)誤次數(shù)明顯減少(P＜0.05)。CON+TPM組大鼠的成績(jī)落后于CON+NS組，每日每輪測(cè)試后10次嘗試中的錯(cuò)誤次數(shù)與前10次相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。其余各組大鼠的表現(xiàn)與相應(yīng)對(duì)照無(wú)明顯差異(P＞0.05)。
　　 2.長(zhǎng)期應(yīng)用抗癲癇藥對(duì)B

14、DNF、神經(jīng)發(fā)生、苔蘚纖維發(fā)芽及SNAP-25的影響。
　　 (1)腦重:EP+NS組大鼠腦重較CON+NS組降低約15％(P＜0.01)。VPA及TPM處理組大鼠腦重均較相應(yīng)對(duì)照組降低（P＜0.05）。EP+LEV組大鼠腦重較EP+NS組增加(P＜0.01)。OXC、LTG處理組及CON+LEV組大鼠腦重與相應(yīng)對(duì)照組無(wú)差異（P＞0.05）。
　　 (2)BDNF:EP+NS組大鼠海馬中BDNFmRNA及蛋白表達(dá)均高于C

15、ON+NS組(P＜0.01)。VPA及TPM處理組大鼠海馬中BDNFmRNA與蛋白的表達(dá)均較相應(yīng)對(duì)照組降低（P＜0.05）。LEV及LTG處理組大鼠海馬中BDNFmRNA與蛋白的表達(dá)較相應(yīng)對(duì)照組增加(P＜0.05)。OXC處理組大鼠的表達(dá)與相應(yīng)對(duì)照組無(wú)差異(P＞0.05)。
　　 (3)神經(jīng)發(fā)生:EP+NS組大鼠海馬齒狀回、CA3區(qū)、門區(qū)和海馬外區(qū)域中BrdU標(biāo)記的細(xì)胞數(shù)較CON+NS組顯著增加（P＜0.01)。EP+LEV組、

16、EP+TPM組、EP+OXC組、EP+LTG組大鼠齒狀回BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均少于EP+NS組(P＜0.05);EP+VPA組大鼠齒狀回BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)則較EP+NS組增多(P＜0.05)。對(duì)照組中所有用藥組大鼠BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與CON+NS組相比均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。
　　 (4)苔蘚纖維發(fā)芽:Timm染色結(jié)果顯示EP+NS組大鼠海馬CA3區(qū)及顆粒上層的Timm記分均高于CON+NS組(P＜0.05)。但所有藥物處

17、理組大鼠CA3區(qū)及顆粒上層的Timm記分與相應(yīng)生理鹽水對(duì)照組相比均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 (5)SNAP-25:EP+NS組大鼠海馬中SNAP-25mRNA及蛋白的表達(dá)低于CON+NS組(P＜0.01)。VPA處理組大鼠SNAP-25mRNA及蛋白的表達(dá)也較相應(yīng)對(duì)照組降低(P＜0.05)。LEV、TPM、OXC及LTG處理組與相應(yīng)對(duì)照組的NAP-25mRNA及蛋白表達(dá)無(wú)差異。(P＞0.05）
　　 結(jié)論：<

18、br>　　 1.不同的抗癲癇藥物對(duì)認(rèn)知的影響不同
　　 (1)VPA損害了癲癇幼鼠及正常幼鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力，但對(duì)工作記憶及活動(dòng)水平無(wú)不良影響;VPA還可使體重增長(zhǎng)加快。
　　 (2)LEV改善了癲癇幼鼠的空間學(xué)習(xí)記憶及工作記憶，但對(duì)正常幼鼠的認(rèn)知無(wú)影響;LEV還增加了癲癇幼鼠及正常幼鼠活動(dòng)水平，但對(duì)體重增長(zhǎng)無(wú)影響。
　　 (3)TPM對(duì)正常幼鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力及工作記憶有不良影響，但未加重癲癇幼鼠的認(rèn)知損

19、害，且不影響發(fā)育期幼鼠的活動(dòng)水平及體重增長(zhǎng)。
　　 (4)LTG對(duì)癲癇幼鼠及正常幼鼠的空間學(xué)習(xí)記憶、工作記憶無(wú)不良影響、但可致體重增長(zhǎng)減慢及活動(dòng)水平降低。
　　 (5)OXC對(duì)癲癇幼鼠及正常幼鼠的空間學(xué)習(xí)記憶、工作記憶、活動(dòng)水平及體重增長(zhǎng)均無(wú)不良影響。
　　 2.不同抗癲癇藥物對(duì)認(rèn)知影響的機(jī)制不同。
　　 (1)VPA可致癲癇幼鼠及正常幼鼠的腦重降低，海馬中BDNF及SNAP-25的表達(dá)減少，只增強(qiáng)癲癇幼

20、鼠的神經(jīng)發(fā)生，不影響正常幼鼠的神經(jīng)發(fā)生及所有大鼠的苔蘚纖維。
　　 (2)LEV可致癲癇大鼠及正常大鼠海馬中BDNF表達(dá)均增高，只使癲癇幼鼠腦重增加及神經(jīng)發(fā)生降低，不影響正常大鼠的腦重、神經(jīng)發(fā)生、以及所有大鼠的苔蘚纖維和海馬中SNAP-25的表達(dá)。
　　 (3)TPM可使癲癇幼鼠及正常幼鼠的腦重降低，海馬中BDNF的表達(dá)減少，只減少癲癇幼鼠神經(jīng)發(fā)生，對(duì)正常幼鼠的神經(jīng)發(fā)生及所有大鼠的苔蘚纖維及SNAP-25的表達(dá)無(wú)影響。<