IL-18Rα抗體在小鼠急性移植物抗宿主病中的應(yīng)用研究.pdf

1、目的：探討應(yīng)用IL-18Rα抗體在小鼠急性移植物抗宿主病(aGVHD)中的作用，為臨床上尋找防治aGVHD的方法提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：1.以8～10周齡雄性C57BL/6小鼠為供鼠，10～12周齡雄性BALB/c小鼠為受鼠，建立aGVHD模型。實(shí)驗(yàn)分為三組：aGVHD模型組(BS組)、全身照射組(TBI組)和正常對照組(Normal組)。移植后觀察受鼠生存率和生存狀態(tài)。流式細(xì)胞術(shù)檢測受鼠外周血中淋巴細(xì)胞嵌合率和輔助性T(Th)

2、細(xì)胞亞群的比例變化；計數(shù)外周血白細(xì)胞數(shù)；觀察移植后小鼠aGVHD的臨床表現(xiàn)和病理改變，評價重要靶器官(肝、肺、小腸、皮膚)的損傷情況。2.應(yīng)用IL-18Rα抗體阻斷IL-18信號通路，觀察aGVHD的發(fā)生及主要靶器官損傷情況。實(shí)驗(yàn)分為三組：IL-18Rα抗體干預(yù)的aGVHD組(干預(yù)組，BS+Ab組)、常規(guī)aGVHD對照組(模型組，BS組)、正常對照組(正常組，Normal組)。正常組不處理，干預(yù)組及BS組小鼠經(jīng)尾靜脈輸注骨髓細(xì)胞和脾細(xì)胞

3、，以建立aGVHD模型。設(shè)移植當(dāng)天為0d，干預(yù)組受鼠于移植-1d～14d，每3天1次腹腔注射anti-IL-18Rα抗體，10μg/只；同時間點(diǎn)BS組注射等體積的PBS。移植后每7d取外周血，用ELISA和CBA方法檢測IL-18及Th細(xì)胞亞群相關(guān)細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4和IL-17A的水平；用FACS術(shù)檢測外周血Th細(xì)胞亞群比例。取靶器官肝、肺、小腸、皮膚等組織，用Real-time PCR、Western blot和IHC等方法

4、檢測IL-18、Fas及FasL的表達(dá)水平。利用TUNEL技術(shù)檢測上述靶器官中細(xì)胞的凋亡情況。
　　結(jié)果：1.aGVHD模型的建立與鑒定：BS組小鼠在照射后7～14d出現(xiàn)明顯aGVHD表現(xiàn)。照射后12d，受鼠體重下降至最低，為初始體重的(80.27±1.42)％，臨床評分達(dá)到高峰，為5.80±0.15。外周血淋巴細(xì)胞嵌合率檢測證實(shí)移植后第5d受鼠血中供鼠來源的淋巴細(xì)胞為(43.51±1.14)％，到第20d時達(dá)到穩(wěn)定嵌合狀態(tài)(98

5、.13±2.15)％。受鼠外周血白細(xì)胞計數(shù)顯示照射后7d達(dá)到清髓狀態(tài)，白細(xì)胞數(shù)低于1.0×109/L，供鼠來源細(xì)胞的植入使受鼠白細(xì)胞數(shù)量逐漸恢復(fù)，同時發(fā)生了aGVHD。外周血Th細(xì)胞亞群中以Th1細(xì)胞比例占優(yōu)勢，15d時達(dá)到(44.28±1.97)％。aGVHD主要靶器官肝、肺、小腸和皮膚的組織病理染色均可觀察到組織的明顯損傷。正常組小鼠生存狀態(tài)好，TBI組小鼠于照射后14d內(nèi)全部死亡，兩組小鼠均無aGVHD的表現(xiàn)。2.與BS組相比，干

6、預(yù)組受鼠的aGVHD的全身表現(xiàn)和主要靶器官的變化：移植后15d，干預(yù)組受鼠評分為3.98±0.55，而BS組受鼠aGVHD臨床評分為6.15±0.82，兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。外周血Th細(xì)胞亞群檢測顯示移植后14d，干預(yù)組的Th1細(xì)胞亞群比例低于BS組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，同時檢測到干預(yù)組外周血中的IFN-γ濃度高于BS組。移植后7d移植組小鼠血中的IL-18濃度明顯升高，干預(yù)組為(44.28±4.38)p

7、g/ml，高于BS組(37.26±2.45)pg/ml，而正常組為(13.37±1.32)pg/ml。檢測干預(yù)組和BS組的肝、肺、小腸和皮膚組織的IL-18、Fas和FasL的基因及蛋白表達(dá)水平及凋亡細(xì)胞數(shù)目，均顯示干預(yù)組的表達(dá)較BS組為低(P<0.05)，干預(yù)組的凋亡細(xì)胞數(shù)及臟器損傷程度亦低于BS組，兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。同時間點(diǎn)正常對照組小鼠的肝、肺、小腸和皮膚組織中這三種細(xì)胞因子的表達(dá)水平及外周血中的Th1細(xì)胞亞