調(diào)節(jié)性γδT細(xì)胞在移植物抗宿主病中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景:
　　移植物抗宿主病(GVHD)是異基因造血干細(xì)胞移植(allo-HSCT)后的主要并發(fā)癥和死亡原因，包括急性GVHD(aGVHD)和慢性GVHD(cGVHD)兩大類。在人類白細(xì)胞抗原(HLA)相合的親緣allo-HSCT中，aGVHD的發(fā)生率為30％～60％，在HLA相合的非親緣和HLA不完全相合的allo-HSCT中，aGVHD的發(fā)生率達(dá)40％～90％。目前短程甲氨蝶呤(MTX)聯(lián)合環(huán)孢菌素A(CSA)是臨床最常用的aG

2、VHD預(yù)防方案，但是仍然有不少患者合并重度和難治性aGVHD，導(dǎo)致移植失敗。T淋巴細(xì)胞去除是預(yù)防aGVHD的有效方法，隨之而來的植入失敗和白血病復(fù)發(fā)使其在臨床上難以廣泛開展。一些新的方案如應(yīng)用新的免疫抑制劑、單克隆抗體等可在一定程度上減少aGVHD的發(fā)生率，但移植物抗白血病(GVL)效應(yīng)減弱，白血病復(fù)發(fā)率、移植后感染發(fā)生率增高，總體生存未見明顯改善。cGVHD可嚴(yán)重影響患者各臟器功能和生活質(zhì)量，是allo-HSCT后的主要遠(yuǎn)期并發(fā)癥和死

3、亡原因。Anasetti C等報(bào)道外周血造血干細(xì)胞移植后2年cGVHD的發(fā)生率為53％,骨髓移植后2年cGVHD的發(fā)生率為41％。治療上目前尚無統(tǒng)一的防治方案。腎上腺皮質(zhì)激素是治療cGVHD的一線藥物，對于腎上腺皮質(zhì)激素難治性cGVHD，新型免疫抑制劑、靶向效應(yīng)免疫細(xì)胞或炎性細(xì)胞因子的各種生物藥物、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞等可能在以后的治療中發(fā)揮重要作用。
　　調(diào)節(jié)性γδT細(xì)胞（γδTreg）于2009年9月在Journal o

4、f Immunology雜志上首次報(bào)道。該細(xì)胞是一群具有免疫抑制功能的新細(xì)胞亞群，它們與CD4+Treg細(xì)胞一樣表達(dá)Foxp3轉(zhuǎn)錄因子，體外研究發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞亞群具有與CD4+Treg細(xì)胞相似的生物學(xué)特性，最主要的功能是通過細(xì)胞與細(xì)胞間直接接觸方式抑制經(jīng)抗CD3和抗CD28單克隆抗體刺激增殖活化的外周血淋巴細(xì)胞;同時也分泌TGF-β1、IL-10等抑制性細(xì)胞因子。Li等最新研究發(fā)現(xiàn)γδTreg細(xì)胞在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者中的比例明顯下降，進(jìn)一步

5、證實(shí)了該細(xì)胞具有負(fù)向免疫調(diào)控作用的生物學(xué)特性。而且該類細(xì)胞可特異性結(jié)合磷酸抗原類化合物如異戊烯焦磷酸(IPP)、唑來膦酸等，同時聯(lián)合IL-2、IL-15和TGF-β1等細(xì)胞因子，可在體外擴(kuò)增并富集，為進(jìn)一步體內(nèi)外研究γδTreg細(xì)胞的生物學(xué)特性提供了可靠的保障。目前報(bào)道的γδTreg細(xì)胞與一般Treg細(xì)胞具有相似的生物學(xué)特性，那么γδTreg細(xì)胞是否具有負(fù)向調(diào)控allo-HSCT后GVHD的生物學(xué)特性？
　　在本研究中我們對γδT

6、reg細(xì)胞的體外誘導(dǎo)擴(kuò)增富集體系進(jìn)行了進(jìn)一步優(yōu)化，對優(yōu)化的機(jī)制進(jìn)行了深入研究;接著對體外誘導(dǎo)擴(kuò)增的γδTreg細(xì)胞在體外和小鼠體內(nèi)的生物學(xué)特性和對GVHD的調(diào)控作用及其相關(guān)機(jī)制進(jìn)行了研究;最后在臨床異基因造血干細(xì)胞移植后患者外周血中γδTreg數(shù)量與GVHD相關(guān)性進(jìn)行了深入的探討。我們的研究進(jìn)一步明確了γδTreg細(xì)胞的生物學(xué)特性，為臨床上建立GVHD防治的新方案提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù);同時，也能為將來應(yīng)用于實(shí)體器官移植排斥反應(yīng)和自身免疫性

7、疾病的治療奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　具體研究分為3部分:
　　1)γδTreg細(xì)胞體外誘導(dǎo)培養(yǎng)體系的建立;2）γδTreg細(xì)胞在體外和動物模型移植物抗宿主病中的調(diào)控作用及其機(jī)制;3）γδTreg細(xì)胞在臨床異基因造血干細(xì)胞后移植物抗宿主病中的調(diào)控作用。
　　第一章、調(diào)節(jié)性γδT細(xì)胞體外誘導(dǎo)培養(yǎng)體系的建立
　　目的:γδTreg細(xì)胞是近來發(fā)現(xiàn)的具有免疫抑制功能的新細(xì)胞亞群，本部分的目的是建立一種高效的γδTreg細(xì)胞體外誘

8、導(dǎo)培養(yǎng)體系，為進(jìn)一步明確γδTreg細(xì)胞的生物學(xué)特性提供研究平臺。
　　方法:從健康成年人外周血中分離單個核細(xì)胞(PBMCs)，加用IL-2、 IL-15、TGF-β1和唑來膦酸(ZOL)進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，第2天部分細(xì)胞加用地西他濱（0-2μmol/ml），第10天應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)(FACS)檢測γδ Treg細(xì)胞含量，F(xiàn)ACS和免疫磁珠分選技術(shù)(MACS)富集γδTreg;接著采用Western blot、分子克隆、轉(zhuǎn)錄因子活性芯片、

9、DNA甲基化測序和啟動子/增強(qiáng)子雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)等技術(shù)研究地西他濱誘導(dǎo)γδTreg細(xì)胞生成的分子機(jī)制。
　　結(jié)果:經(jīng)過10天培養(yǎng)后單用細(xì)胞因子誘導(dǎo)組生成36.2±5.7％的γδTreg(commonγδTreg)，細(xì)胞因子聯(lián)合0.5μg/ml地西他濱組生成59.9±7.8％的γδTregs（DEC-inducedγδTreg）。兩組γδTregs細(xì)胞中Foxp3的平均熒光強(qiáng)度分別為52.6±8.9和182±9.9(p＜0.05)

10、;地西他濱作用后γδT細(xì)胞中NF-κB表達(dá)上調(diào)和Foxp3基因上游增強(qiáng)子（-5031至-4792）和CNS3(3824-3938)區(qū)域去甲基化引起的增強(qiáng)子活性增加在誘導(dǎo)γδTreg生成中起關(guān)鍵作用。
　　結(jié)論:本研究首次報(bào)道了地西他濱0.5μmol/1，IL-226.0U/ml，IL-1550ng/ml和TGF-β18.5ng/ml能高效誘導(dǎo)γδTreg細(xì)胞的生成，建立了高效的γδTreg細(xì)胞體外誘導(dǎo)培養(yǎng)體系。地西他濱通過上調(diào)NF

11、-κB表達(dá)和Foxp3基因上游增強(qiáng)子和CNS3區(qū)域去甲基化引起的增強(qiáng)子活性增加進(jìn)而誘導(dǎo)γδTreg細(xì)胞的生成。本章建立的誘導(dǎo)培養(yǎng)體系已獲國家發(fā)明專利授權(quán);且部分研究結(jié)果已發(fā)表于國際著名雜志Leukemia上。
　　第二章、γδTreg細(xì)胞在體外和動物模型移植物抗宿主病中的調(diào)控作用及其機(jī)制
　　目的:在第一章中我們加用地西他濱建立了高效的γδTreg細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)體系，本章的目的是明確本體系誘導(dǎo)培養(yǎng)的γδTreg細(xì)胞在體外和動物

12、模型GVHD中的調(diào)控作用以及進(jìn)一步闡明相應(yīng)的分子機(jī)制。
　　方法:采用CFSE標(biāo)記的淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)比較加用和不加用地西他濱誘導(dǎo)的γδTreg細(xì)胞(分別稱為DEC-inducedγδTregs和CommonγδTregs)抑制經(jīng)抗CD3和抗CD28刺激的T淋巴細(xì)胞的增殖能力，反應(yīng)上清液中采用ELISA和Flowcytomix方法檢測TNF-α、 INF-γ、IL-4、 IL-10和TGF-β1水平，流式細(xì)胞術(shù)檢測γδTregs細(xì)胞

13、表面標(biāo)記，最后在經(jīng)環(huán)磷酰胺(CTX)和抗CD122預(yù)處理的NOD/SCID小鼠體內(nèi)輸注經(jīng)植物血凝素(PHA)活化的人PBMCs建立異種GVHD模型，在該模型基礎(chǔ)上進(jìn)一步比較加用和不加用地西他濱誘導(dǎo)的γδTreg過繼免疫輸注對小鼠異種GVHD的調(diào)控作用。
　　結(jié)果:
　　1）在淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)commonγδTregs和DEC-inducedγδTregs均能抑制PBMCs的增殖，但是DEC-inducedγδTregs

14、抑制PBMCs增殖的作用更明顯，而γδT細(xì)胞并無抑制PBMCs增殖的能力;
　　2）DEC-inducedγδTregs與commonγδTregs相比在體外更具穩(wěn)定性;
　　3）HLA-DR和可誘導(dǎo)共刺激分子(ICOS)在DEC-inducedγδTregs中的表達(dá)水平明顯上調(diào);
　　4）DEC-inducedγδTregs比commonγδTregs分泌更多地抑制性細(xì)胞因子IL-10和TGF-β1;
　　5）

15、兩種γδTreg細(xì)胞在NOD/SCID小鼠異種GVHD模型中具有保護(hù)作用，而DEC-inducedγδTreg對GVHD的免疫保護(hù)作用比commonγδTregs更強(qiáng)，commonγδTregs細(xì)胞組和DEC-inducedγδTreg細(xì)胞組小鼠的平均生存時間分別為32.0±2.2和45.5±4.3天(P＜0.01)。
　　結(jié)論:我們首次發(fā)現(xiàn)DEC-inducedγδTreg比commonγδTreg具有更強(qiáng)的負(fù)向免疫調(diào)控功能包括

16、負(fù)向調(diào)控GVHD，更穩(wěn)定的細(xì)胞免疫表型、更好的細(xì)胞活化狀態(tài)、增強(qiáng)的Foxp3表達(dá)水平以及增高的抑制性細(xì)胞因子分泌水平等是該細(xì)胞免疫調(diào)控功能增強(qiáng)的主要機(jī)制。本章中我們建立的NOD/SCID小鼠異種GVHD模型已申請國家發(fā)明專利，且部分內(nèi)容已發(fā)表于國際著名雜志Leukemia和Annals ofHematology。
　　第三章、γδTreg細(xì)胞在臨床異基因造血干細(xì)胞后移植物抗宿主病中的調(diào)控作用
　　目的:為了進(jìn)一步明確γδTr

17、eg細(xì)胞在臨床allo-HSCT后aGVHD和cGVHD中的調(diào)控作用。
　　方法:選取2000年1月至2012年12月在浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院骨髓移植中心接受allo-HSCT治療的患者，其中，aGVHD研究對象為2012年6月至12月在浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院骨髓移植中心接受allo-HSCT的患者，患者于造血干細(xì)胞回輸后每周一次抽取外周靜脈血樣本，共4周，接著每月一次抽取外周靜脈血，共2月。cGVHD研究對象為allo-

18、HSCT術(shù)后1年及以上門診隨訪者，包括無cGVHD隨訪者和合并cGVHD者，抽取患者肝素抗凝外周血10ml，采用FACS對外周血中γδTreg細(xì)胞占γδT細(xì)胞百分含量、CD4/CD8比例進(jìn)行檢測，并結(jié)合臨床GVHD資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，同時我們收集了10名健康志愿者外周血作為正常對照。
　　結(jié)果:在aGVHD研究中，共收集39例allo-HSCT后三個月患者外周血，其中21例發(fā)生aGVHD，我們發(fā)現(xiàn)allo-HSCT術(shù)后前3月γδTr

19、eg細(xì)胞含量很低，考慮γδTreg細(xì)胞尚未免疫重建，不參與aGVHD的調(diào)控。在cGVHD研究中，共收集41例患者，其中，15例為無cGVHD患者，26例為合并cGVHD患者，我們發(fā)現(xiàn)健康志愿者和cGVHD患者兩組中的γδTreg細(xì)胞含量不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但合并cGVHD患者中的γδTreg細(xì)胞含量比在健康志愿者中有增高趨勢;而cGVHD患者和無cGVHD患者兩組中的γδTreg細(xì)胞含量具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.044)，allo-HSCT