調(diào)節(jié)性淋巴細胞在Graves病發(fā)病中的作用及機制研究.pdf

1、第一部分調(diào)節(jié)性B細胞在Graves病發(fā)病中的作用及機制研究
　?。ㄒ唬?Graves病患者外周血調(diào)節(jié)性B細胞的表型鑒定及數(shù)量分析
　　目的: 通過體外實驗確定Graves病患者外周血調(diào)節(jié)性B細胞歸屬的亞群，比較Graves病患者和健康志愿者外周血調(diào)節(jié)性B細胞亞群數(shù)量的差異;
　　方法: 本課題組自2011年2月至2011年11月在內(nèi)分泌科門診及病房入選Graves病初發(fā)患者15例、病情控制患者19例、健康志愿者36例。

2、收集受試者外周血，分離外周血單個核細胞，加入CpG+PIB培養(yǎng)5小時，流式細胞儀檢測并比較Graves病患者和健康志愿者外周血CD19+IL-10+調(diào)節(jié)性B細胞的百分含量;流式細胞分選儀分選CD19+B淋巴細胞，Real-Time PCR檢測并比較Graves病患者和健康志愿者外周血CD19+B淋巴細胞的IL-10 mRNA表達水平的差異;比較IL-10+及IL-10-外周血單個核細胞各種分化抗原標志(CD19、CD24、CD38、Ig

3、M、IgD、CD5、CD10、CD27、CD1d)銀光強度的差異，確定Graves病患者外周血調(diào)節(jié)性B細胞歸屬的亞群，并用流式細胞儀檢測并比較Graves病患者和健康志愿者外周血調(diào)節(jié)性B細胞亞群百分含量的差異;
　　結果: Graves病初發(fā)患者外周血CD19+IL-10+調(diào)節(jié)性B細胞百分含量及IL-10mRNA表達水平比病情控制患者和健康人明顯減少(P＜0.05);Graves病患者外周血CD19+CD24hiCD27+B細胞亞

4、群屬于調(diào)節(jié)性B細胞，Graves病初發(fā)患者外周血CD19+CD24hiCD27+B細胞百分含量比病情控制患者和健康人明顯減少(P＜0.05)。
　　結論: Graves病患者外周血CD19+IL-10+調(diào)節(jié)性B細胞和CD19+CD24hiCD27+B細胞亞群的百分含量較病情控制患者和健康人明顯減少，這表明調(diào)節(jié)性B細胞在Graves病的發(fā)病中可能起到了一定作用。
　　（二）Graves病患者外周血調(diào)節(jié)性B細胞的功能分析及機制研

5、究
　　目的: 比較Graves病患者和健康志愿者外周血CD19+CD24hiCD27+B細胞對CD4+T細胞免疫抑制功能的差異，并探討其發(fā)揮免疫抑制作用的途徑;
　　方法: 本課題組自2011年7月至2011年12月在內(nèi)分泌科門診及病房入選初發(fā)患者6例、病情控制患者6例、健康自愿者6例。收集受試者外周血，分離純化的外周血CD19+CD24hiCD27+B細胞及CD4+T細胞共培養(yǎng)，培養(yǎng)液中加入CpG、CD40L和抗-CD3

6、共培養(yǎng)5天，最后6小時加入PIB，BrdU ELISA方法檢測Graves病患者和健康志愿者外周血CD4+T細胞增殖水平，流式細胞儀檢測并比較Graves病患者和健康志愿者外周血CD4+IFN-γ+和CD4+TNF-α+百分含量的差異;在共培養(yǎng)體系中加入IL-10抗體，探討IL-10在CD19+CD24hiCD27+B細胞發(fā)揮免疫抑制功能中所起的作用;流式細胞儀檢測共培養(yǎng)體系中CD4+CD25hiCD127loFoxp3+調(diào)節(jié)性T細胞含

7、量，探討調(diào)節(jié)性T細胞在CD19ED24hiCD27+B細胞發(fā)揮免疫抑制功能中所起的作用;
　　結果: 與健康志愿者比較，Graves病初發(fā)和病情控制患者CD19+CD24hiCD27+B細胞分泌IL-10明顯減少(P＜0.05)，Graves病初發(fā)和病情控制患者外周血CD19+CD24hiCD27+B細胞亞群對CD4+T細胞增生和分泌IFN-γ、TNF-α的抑制作用明顯減弱(P＜0.05)。外周血中CD19+CD24hiCD27+

8、B細胞通過IL-10抑制CD4+T細胞分泌IFN-γ，但不通過IL10抑制CD4+T細胞增生和CD4+T細胞分泌TNF-α;和健康志愿者比較，Graves病初發(fā)和病情控制患者外周血CD19+CD24hiCD27+B細胞亞群誘導產(chǎn)生CD4+CD25hiCD127loFoxp3+調(diào)節(jié)性T細胞的數(shù)量減少導致其免疫抑制功能下降。
　　結論: Graves病初發(fā)和病情控制患者外周血CD19+CD24hiCD27+B細胞免疫抑制功能較健康人

9、明顯減少，這表明調(diào)節(jié)性B細胞在Graves病的發(fā)生、發(fā)展過程中可能起到了一定作用。病情控制的患者CD19+CD24hiCD27+B細胞亞群的免疫抑制功能仍明顯低于正常人，這說明目前臨床常用的藥物能使Graves病患者本身的免疫缺陷部分改善，但不能得以完全恢復。
　　第二部分調(diào)節(jié)性T細胞在Graves病發(fā)病中的作用
　　目的: 通過對不同階段Graves病患者外周血中淋巴細胞亞群數(shù)量以及CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞功能的測定

10、，研究調(diào)節(jié)性T細胞在Graves病發(fā)病中的作用。
　　方法: 采集初發(fā)、病情控制的Graves病患者組以及健康人組等3組人群的外周血。流式細胞儀檢測各淋巴細胞亞群的百分率，Real-Time PCR檢測外周血單個核細胞的Foxp3mRNA;免疫磁珠體外分離CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞，應用MTT法檢測其對CD4+CD25-T細胞的免疫抑制功能。
　　結果: 和健康人相比，Graves病初發(fā)患者外周血中的CD3+CD4+T和

11、CD3(-)CD19+B細胞均顯著增加（P＜0.05）;CD3-CD16+CD56+NK細胞則顯著減少（P＜0.05）;而病情控制患者各淋巴細胞亞群無明顯變化。Graves病初發(fā)和病情控制患者外周血CD4+CD25+ Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞數(shù)量及Foxp3mRNA表達水平和健康人之間雖無明顯變化，但他們的免疫抑制功能明顯下降，其中初發(fā)患者調(diào)節(jié)性T細胞的免疫抑制功能比病情控制患者明顯下降(P＜0.05)。
　　結論: Grave