GSK3β調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬在皮膚鱗癌發(fā)病中的作用及分子機(jī)制.pdf

1、皮膚鱗狀細(xì)胞癌（Squamouscellcarcinoma,SCC）是皮膚科常見(jiàn)的惡性腫瘤，發(fā)病率逐年增加，可多發(fā)，常在短期內(nèi)快速生長(zhǎng)，易形成潰瘍及轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重影響患者的健康。目前，皮膚鱗癌確切的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，治療方法多為手術(shù)切除等對(duì)癥處理，與其他惡性腫瘤一樣缺乏根治的方法。因此，尋找新的、有效的治療靶點(diǎn)一直是國(guó)內(nèi)外皮膚科學(xué)界密切關(guān)注的研究熱點(diǎn)。
　　糖原合成激酶3β（Glycogensynthasekinase3β,GSK3β

2、）是一種普遍存在于細(xì)胞內(nèi)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，參與眾多信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)，在胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡、干細(xì)胞維持和腫瘤形成等方面發(fā)揮重要的作用，被公認(rèn)為是一種決定細(xì)胞命運(yùn)的關(guān)鍵激酶。紫外線(Ultravioletradiation,UV)尤其是UVB，為誘發(fā)皮膚鱗癌的主要原因之一。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)GSK3β在抑制角質(zhì)形成細(xì)胞惡性增殖中起著至關(guān)重要的作用，但是確切的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步討論。細(xì)胞自噬是機(jī)體一種重要的防御和保護(hù)機(jī)制。

3、細(xì)胞通過(guò)自噬來(lái)降解和清除變性受損、衰老和失去功能的細(xì)胞器、蛋白等，在機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)、腫瘤形成等相關(guān)疾病中具有十分重要的作用。大量研究表明UV可提高細(xì)胞自噬水平，GSK3β的抑制劑在其它組織中可通過(guò)抑制細(xì)胞自噬起到保護(hù)細(xì)胞的作用。那么在皮膚鱗癌的發(fā)病過(guò)程中，GSK3β是否可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬發(fā)揮作用？其作用機(jī)制又是什么？這些都需要進(jìn)一步研究。本研究擬以皮膚鱗癌、癌前病變?nèi)展庑越腔〖靶∈笊掀ぜ?xì)胞JB6為主要研究對(duì)象，首先利用免疫

4、組織化學(xué)技術(shù)和Westernblot法檢測(cè)GSK3β及其磷酸化水平在皮膚鱗癌和日光性角化病組織中的表達(dá)，其次采用建立表達(dá)不同GSK3β活性的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，觀察UVB誘導(dǎo)下，GSK3β對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響并探討可能的作用分子機(jī)制，為進(jìn)一步明確皮膚鱗癌的發(fā)病機(jī)制及治療提供理論依據(jù)。
　　研究目的：
　　以皮膚鱗癌、日光性角化病及正常小鼠上皮細(xì)胞JB6為主要研究對(duì)象，通過(guò)組織、細(xì)胞和分子水平實(shí)驗(yàn)：
　?。?）觀察GSK3β與皮

5、膚鱗癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系；
　　（2）觀察GSK3β對(duì)UVB作用下細(xì)胞生長(zhǎng)的影響；
　?。?）探討GSK3β發(fā)揮作用的信號(hào)通路，并初步闡明UVB作用下GSK3β調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬的分子機(jī)制。
　　研究?jī)?nèi)容和方法：
　　1.采用免疫組織化學(xué)技術(shù)及Westernblot檢測(cè)法觀察GSK3β在皮膚鱗癌及其癌前病變?nèi)展庑越腔〗M織中的表達(dá)并進(jìn)行分析，系統(tǒng)評(píng)價(jià)GSK3β與皮膚鱗癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系；
　　2.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染：脂質(zhì)體法將

6、3種表達(dá)不同GSK3β活性的質(zhì)粒：pCDNA3/GSK3β-WT、pCDNA3/GSK3β-S9A、pCDNA3/GSK3β-K85R轉(zhuǎn)染至小鼠上皮細(xì)胞JB6細(xì)胞株，并篩選、鑒定穩(wěn)定表達(dá)不同GSK3β活性的細(xì)胞株；
　　3.細(xì)胞增殖檢測(cè)：MTT法檢測(cè)UVB誘導(dǎo)下，GSK3β對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響；
　　4.Westernblot和GFP-LC3瞬時(shí)轉(zhuǎn)染法檢測(cè)：UVB誘導(dǎo)下，細(xì)胞自噬水平的變化和GSK3β對(duì)細(xì)胞自噬的影響及其分子機(jī)制

7、。
　　研究結(jié)果：
　　1.GSK3β蛋白在皮膚鱗癌組織中表達(dá)下降，癌前病變更為明顯；p-GSK3βSer9蛋白在病變組織中表達(dá)均高于正常組織，且在癌前病變中表達(dá)最高；p-GSK3βTyr216蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異；
　　2.在UVB誘導(dǎo)下，激活GSK3β（GSK3β-WT和GSK3β-S9A轉(zhuǎn)染組）可明顯降低細(xì)胞存活和細(xì)胞自噬水平；而抑制GSK3β（GSK3β抑制劑氯化鋰處理組和GSK3β-K85R轉(zhuǎn)染組）則可增加細(xì)胞

8、存活和細(xì)胞自噬水平；
　　3.抑制細(xì)胞自噬可增加UVB誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡；而促進(jìn)細(xì)胞自噬則減少UVB誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡；
　　4.GSK3β抑制劑氯化鋰處理小鼠上皮細(xì)胞JB6后，pAMPKThr172蛋白表達(dá)呈時(shí)間依賴性增強(qiáng)，而PKR、AKT、PERK蛋白表達(dá)未見(jiàn)明顯改變；
　　5.UVB作用下，細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin1及GSK3β抑制位點(diǎn)p-GSK3βSer9蛋白表達(dá)呈時(shí)間依賴性遞增，而GSK3β活化位點(diǎn)p-G

9、SK3βTyr216蛋白表達(dá)呈時(shí)間依賴性遞減。
　　結(jié)論：.
　　1.GSK3β功能在皮膚鱗癌及其癌前病變中是被抑制的，其功能的抑制與皮膚鱗癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)；
　　2.激活GSK3β可減少UVB誘導(dǎo)的細(xì)胞存活，而抑制GSK3β，則增加UVB誘導(dǎo)的細(xì)胞存活，提示GSK3β對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)具有負(fù)調(diào)控作用；
　　3.抑制GSK3β可提高pAMPKThr172蛋白的水平和細(xì)胞自噬的表達(dá)，提示GSK3β很可能通過(guò)抑制LKB