TXNIP在高糖誘導(dǎo)小鼠腎小球系膜細(xì)胞自噬中的作用及分子機(jī)制.pdf

1、目的：糖尿病腎?。―iabetic nephropathy,DN）是糖尿病最常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，糖尿病患者一旦出現(xiàn)明顯蛋白尿則病情通常難以逆轉(zhuǎn)，往往發(fā)展至終末期腎功能衰竭，是導(dǎo)致糖尿病患者死亡的主要原因之一。
　　近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞自噬（Autophagy）在DN中扮演著重要的角色。自噬是細(xì)胞內(nèi)一個(gè)基本過(guò)程，它將細(xì)胞內(nèi)成分運(yùn)輸?shù)饺苊阁w降解，維持著體內(nèi)平衡和細(xì)胞完整性。正常情況下，細(xì)胞自噬功能處于基礎(chǔ)水平，以維持細(xì)胞正常的生理功能

2、。越來(lái)越多的研究表明，細(xì)胞自噬受損與糖尿病腎病之間密切相關(guān)，并參與了糖尿病腎病的發(fā)生與發(fā)展。在 STZ誘導(dǎo)的早期糖尿病小鼠腎小管上皮細(xì)胞中，自噬標(biāo)志物 LC3-II和自噬溶酶體降解產(chǎn)物P62表達(dá)增多提示自噬活性可能減弱。
　　硫氧還蛋白相互作用蛋白（Thioredoxin interacting protein,TXNIP）在細(xì)胞內(nèi)普遍存在，高糖能夠誘導(dǎo)TXNIP過(guò)表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，引起細(xì)胞損傷和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白沉積，

3、促進(jìn)細(xì)胞凋亡。我們先前已有研究表明高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞 TXNIP表達(dá)明顯上調(diào)，活性氧（Reactive oxygen species,ROS）產(chǎn)生增多，系膜細(xì)胞出現(xiàn)凋亡與表型轉(zhuǎn)化。
　　目前，有研究結(jié)果顯示，糖尿病腎病患者的腎小管上皮細(xì)胞自噬活性減弱，自噬體累積過(guò)多，自噬標(biāo)志蛋白 LC3-II和溶酶體降解標(biāo)記物 P62表達(dá)增高；在腎小管上皮HK-2細(xì)胞中，敲低TXNIP后自噬活性明顯增強(qiáng)，提示TXNIP與糖尿病腎小管細(xì)胞自噬損傷有

4、關(guān)。但是，TXNIP在高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞自噬中的作用還未見(jiàn)報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外培養(yǎng)的小鼠系膜細(xì)胞（Mouse mesangial cells,MMCs），研究高糖條件下MMC細(xì)胞中TXNIP與自噬的關(guān)系并探索其相關(guān)分子機(jī)制。
　　方法：pBAsim-U6-Neo-TXNIP siRNA干擾質(zhì)粒，使用FuGENER6轉(zhuǎn)染試劑將TXNIP siRNA質(zhì)粒和空白質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染MMCs在37°C，5％CO2培養(yǎng)箱中，以含10%胎

5、牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞,并將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分組：①正常對(duì)照組（5.5 mmol/L glucose,NG）、甘露醇對(duì)照組（5.5 mmol/L glucose+24.5mmol/L mannitol,M）、高糖組（30 mmol/L glucose,HG）干預(yù)刺激2、6、12、24、48、72小時(shí)后收集細(xì)胞;②正常對(duì)照組（5.5 mmol/L glucose,NG）、甘露醇對(duì)照組（5.5 mmol/L glucose+24.5

6、mmol/L mannitol,M）、高糖組（30 mmol/L glucose,HG）、空白質(zhì)粒對(duì)照組（30 mmol/L glucose+pBAsim-U6-Neo質(zhì)粒,HG+V）、TXNIP siRNA敲低組（30 mmol/L glucose+pBAsim-U6-Neo-TXNIP siRNA質(zhì)粒,HG+T）、巴佛洛霉素組（5.5 mmol/L glucose+50 nmol/L Bafilomycin A1,BA組）、硝基酪氨

7、酸組(30 mmol/L glucose+pBAsim-U6-Neo-TXNIP siRNA質(zhì)粒+0.02 mg/ml Nitrotyrosine,HG+T+N）、雷帕霉素組(30 mmol/L glucose+1 ng/ml Rapamycin,HG+R）都在干預(yù)刺激24小時(shí)后收集細(xì)胞。采用Western blot檢測(cè) TXNIP、LC3-II、P62、Nitrotyrosine和 p-mTORC1蛋白表達(dá)；采用Real-time P

8、CR檢測(cè)TXNIP、LC3-II和P62 mRNA表達(dá)；倒置顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞形態(tài)學(xué)；透射電鏡和共聚焦顯微鏡檢測(cè)自噬體；流式細(xì)胞術(shù)和MitoSOX檢測(cè)ROS。
　　結(jié)果：
　　1高糖對(duì)系膜細(xì)胞自噬的影響。
　　與正常對(duì)照組相比，經(jīng)高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞中TXNIP、LC3-II和P62的表達(dá)隨時(shí)間點(diǎn)呈波峰變化，且在24h時(shí)達(dá)到峰值；甘露醇對(duì)照組中系膜細(xì)胞中TXNIP、P62及LC3-II表達(dá)未見(jiàn)明顯變化。
　　2系膜細(xì)胞

9、的形態(tài)變化。
　　倒置顯微鏡觀察結(jié)果顯示，正常對(duì)照組及甘露醇對(duì)照組中系膜細(xì)胞呈星多角形、不規(guī)則、貼壁生長(zhǎng)；經(jīng)高糖和巴佛洛霉素A1誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞呈橢圓形、與瓶底的粘附性下降；而TXNIP敲低組的系膜細(xì)胞形態(tài)相比高糖組呈多角形、與瓶底粘附性增高。
　　3敲低TXNIP對(duì)高糖誘導(dǎo)系膜細(xì)胞自噬體的影響。
　　透射電鏡觀察結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，經(jīng)高糖和巴佛洛霉素A1誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞中檢測(cè)到自噬體明顯增多；而甘露醇對(duì)照組無(wú)明顯

10、改變；TXNIP敲低組相比于高糖組，自噬體明顯減少。
　　4敲低TXNIP對(duì)高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。
　　與正常對(duì)照組相比，經(jīng)高糖和巴佛洛霉素A1誘導(dǎo)之后，系膜細(xì)胞中TXNIP、LC3-II、P62和p-mTORC1表達(dá)顯著增高；而甘露醇對(duì)照組系膜細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)未見(jiàn)明顯變化；TXNIP敲低組系膜細(xì)胞中的TXNIP、LC3-II、P62和p-mTORC1相比于高糖組表達(dá)明顯減少。
　　5敲低TXN

11、IP對(duì)高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞ROS的影響。
　　與正常對(duì)照組相比，經(jīng)高糖、巴佛洛霉素A1誘導(dǎo)之后，系膜細(xì)胞中的ROS產(chǎn)生增多；然而，相比于高糖組，TXNIP敲低組及硝酸酪氨酸組系膜細(xì)胞中ROS生成明顯減少。
　　6雷帕霉素對(duì)高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞自噬的影響
　　與正常對(duì)照組相比，經(jīng)高糖誘導(dǎo)之后，系膜細(xì)胞中TXNIP、LC3-II、P62、p-mTORC1和Nitrotyrosine表達(dá)增高；經(jīng)雷帕霉素處理之后系膜細(xì)胞中TXNI