Swiprosin-1在高糖誘導(dǎo)的腎小球內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中的作用研究.pdf

1、糖尿病腎?。―iabetic nephropathy,DN）是糖尿病患者最重要的致死性微血管合并癥之一，主要是伴隨蛋白尿產(chǎn)生、腎小球率過濾增加、血尿素氮和肌酐濃度增高、腎小球硬化等病理特征的慢性代謝性疾病。糖尿病腎病也是導(dǎo)致終末期腎病的主要原因。事實(shí)上，糖尿病腎病主要是指糖尿病性腎小球硬化癥，是一種以微血管受損為重要特征的腎小球病變。腎小球內(nèi)皮細(xì)胞是組成腎小球的主要細(xì)胞之一，主要保障腎小球毛細(xì)血管的濾過作用及原尿生成。由于腎小球內(nèi)皮細(xì)胞

2、直接與血液接觸，因此可直接受到高血糖的影響。研究證實(shí)，腎小球內(nèi)皮細(xì)胞受損是引起腎小球系膜細(xì)胞病變及腎小球硬化的始發(fā)因素，與糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。而細(xì)胞凋亡是腎小球細(xì)胞受損的一個重要標(biāo)志，已有研究發(fā)現(xiàn)糖尿病或高糖刺激導(dǎo)致腎小球系膜細(xì)胞、足細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，但有關(guān)糖尿病腎病時腎小球內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的確切機(jī)制尚不清楚。
　　Swiprosin-1是2004年首次報道發(fā)現(xiàn)的分子量約為27KD的一種新型鈣結(jié)合蛋白，截至目前pubmed

3、檢索僅有20篇相關(guān)文獻(xiàn)報道，并主要集中在免疫細(xì)胞及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等研究領(lǐng)域。近年來，我們課題組也圍繞swiprosin-1進(jìn)行一些探索性研究，結(jié)合文獻(xiàn)檢索，我們證實(shí)了不管是嚙齒類動物如大鼠、小鼠，還是靈長類動物如人、食蟹猴等的腎小球中都有swiprosin-1的表達(dá)和分布。進(jìn)一步應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)swiprosin-1在腎組織中的腎小球內(nèi)皮細(xì)胞有適度表達(dá)。隨后，我們通過對I型糖尿病模型小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，隨著造模時間的增

4、長，尿蛋白水平不斷增加，腎小球?yàn)V過率降低，而swiprosin-1在腎小球內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)不斷增加，并伴隨腎小球內(nèi)皮細(xì)胞凋亡數(shù)目的上升。因此，我們推測腎小球內(nèi)皮細(xì)胞特異性表達(dá)的 swiprosin-1可能與腎小球內(nèi)皮細(xì)胞凋亡相關(guān)，從而影響糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展。
　　本課題以swiprosin-1為中心，試圖闡明swiprosin-1在糖尿病腎病發(fā)生和發(fā)展中的作用，確定高糖環(huán)境下swiprosin-1對腎小球內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響作用及機(jī)

5、制，為進(jìn)一步明確swiprosin-1作為一個新型的抗糖尿病腎病藥物靶點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。根據(jù)此目的，我們進(jìn)行了相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)。具體實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果如下：
　　一、Swiprosin-1在腎小球內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)
　　1.應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)swiprosin-1在小鼠、食蟹猴等動物腎小球有表達(dá)分布。
　　2.應(yīng)用免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)swiprosin-1在小鼠腎小球內(nèi)皮細(xì)胞中有表達(dá)分布。
　　3.應(yīng)用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)

6、發(fā)現(xiàn)swiprosin-1在人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞中有表達(dá)，并主要分布在細(xì)胞漿。
　　二、糖尿病或高糖刺激上調(diào)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞 swiprosin-1的表達(dá)及其凋亡數(shù)目
　　1.單劑量注射鏈脲佐菌素誘導(dǎo)C57BL/6小鼠糖尿病腎病，在第16w檢測小鼠各項(xiàng)指標(biāo)，與對照組相比血糖升高[(30±2.89)mM vs(6.6±0.29)mM，P<0.01]，腎比重增加[(14.8±0.47)×10-3 vs(11.3±0.11)×10-3，

7、P<0.001]，尿蛋白升高[(369.7±15.39)mg/L vs(240.8±10.82) mg/L,P<0.01]，體重下降[(25.1±0.71)g vs(28.7±0.81)g,P<0.01]，腎小球?yàn)V過率下降[(50.4±0.51)μg/L vs(67.6±9.86)μg/L, P<0.05]。
　　2.鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病腎病小鼠腎皮質(zhì)中swiprosin-1表達(dá)在第8、16w顯著性增加。
　　3.免疫熒光

8、組織化學(xué)技術(shù)驗(yàn)證糖尿病腎病小鼠的腎小球內(nèi)皮細(xì)胞中swiprosin-1表達(dá)明顯增加，并伴隨其凋亡數(shù)目的增多。
　　4.體外給予人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞高糖刺激，葡萄糖濃度為11mmol和33mmol時均可顯著性增加 swiprosin-1的表達(dá)，刺激時間為24、48、96h可顯著性增加 swiprosin-1的表達(dá)。
　　5.體外給予人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞高糖刺激24、48、96h可顯著性降低細(xì)胞增殖活力，增加細(xì)胞毒力。
　　三、動

9、物水平上驗(yàn)證敲除swiprosin-1后可減少糖尿病引起的腎小球內(nèi)皮細(xì)胞凋亡
　　單劑量注射鏈脲佐菌素誘導(dǎo)swiprosin-1-/-和swiprosin-1+/+小鼠糖尿病腎病后，應(yīng)用免疫組織熒光化學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)swiprosin-1-/-組糖尿病腎病小鼠中腎小球內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡數(shù)明顯低于swiprosin-1+/+組。
　　四、Swiprosin-1促進(jìn)高糖誘導(dǎo)的腎小球內(nèi)皮細(xì)胞凋亡
　　1.Swiprosin-1過表達(dá)慢

10、病毒轉(zhuǎn)染人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞，增加swiprosin-1在腎小球內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)，可顯著性降低人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞的增殖活力，增加核固縮細(xì)胞數(shù)目及細(xì)胞凋亡率。
　　2.Swiprosin-1干擾慢病毒轉(zhuǎn)染人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞，減少 swiprosin-1在腎小球內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)，對腎小球內(nèi)皮細(xì)胞的增殖活力、細(xì)胞核固縮程度及細(xì)胞凋亡率沒有影響。給予高糖刺激后，對照組的細(xì)胞增值活力顯著性降低，核固縮細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞凋亡率均顯著性增加。然而干擾組的細(xì)胞增殖

11、活力、核固縮及凋亡率均未受到高糖影響。
　　五、高糖通過PKCβI信號通路上調(diào)swiprosin-1的表達(dá)
　　1.鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病腎病小鼠腎皮質(zhì)內(nèi)PKCβI和swiprosin-1的表達(dá)均顯著性增加。給予糖尿病腎病小鼠LY333531治療8w后，其腎皮質(zhì)中PKCβI和swiprosin-1的表達(dá)顯著性降低。
　　2.免疫熒光組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證給予糖尿病腎病小鼠PKCβI抑制劑治療8w后，腎小球內(nèi)皮細(xì)胞中swipr

12、osin-1表達(dá)及其凋亡數(shù)目均明顯減少。
　　3.體外高糖刺激，給予人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞PKCβI抑制劑處理96h后，細(xì)胞內(nèi)PKCβI和swiprosin-1的表達(dá)減少。
　　4.體外高糖刺激，激動PKCβI的作用使人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞增殖活力降低，而抑制PKCβI的作用對細(xì)胞增殖活力沒有影響。然而，體外高糖刺激，PKCβI抑制劑可抑制高糖降低細(xì)胞增殖活力的作用。
　　六、Swiprosin-1促進(jìn)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制

13、
　　1.Swiprosin-1慢病毒轉(zhuǎn)染人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞，增加swiprosin-1在腎小球內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)，可顯著性升高激活型caspase3、caspase9和促凋亡蛋白bax的表達(dá)。干擾swiprosin-1在腎小球內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)，不影響caspase9等促凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。體外高糖刺激，干擾swiprosin-1的表達(dá)可以抑制高糖誘導(dǎo)的激活型caspase3、caspase9和促凋亡蛋白 bax表達(dá)的上調(diào)。
　　2

14、.Swiprosin-1慢病毒轉(zhuǎn)染人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞，增加swiprosin-1在腎小球內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)后，caspase9的活性升高。干擾swiprosin-1在腎小球內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)，不影響caspase9的活性，但給予高糖刺激后，干擾組的caspase9的活性較對照干擾組明顯降低。
　　3.Swiprosin-1過表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染增加 swiprosin-1在人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)后，應(yīng)用免疫細(xì)胞熒光化學(xué)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞色素C的釋放明顯增加

15、。
　　4.Swiprosin-1過表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染增加swiprosin-1在人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)后，應(yīng)用免疫沉淀技術(shù)發(fā)現(xiàn)swiprosin-1/pro-caspase9復(fù)合體和Apaf-1/pro-caspase9/Cyt-c復(fù)合體的含量均明顯增加。
　　結(jié)論
　　1.Swiprosin-1介導(dǎo)高糖誘導(dǎo)的腎小球內(nèi)皮細(xì)胞凋亡；
　　2.高糖刺激增加PKCβI的表達(dá)，可上調(diào)swiprosin-1的表達(dá)水平，促進(jìn)細(xì)