RNA干擾AE2基因表達(dá)在高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中的作用.pdf

1、目的:研究人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)轉(zhuǎn)染AE2shRNA后在高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中的作用。
　　 方法:將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株CRL-2480,均勻接種在六孔培養(yǎng)板上,隨機(jī)分為四個(gè)組:未轉(zhuǎn)染正常對照(Control)組、高糖(HG)組、轉(zhuǎn)染非特異shRNA(陰性對照組,Non—silencing shRNA)組、轉(zhuǎn)染AE2 shRNA(RNAi)組。除Control組外,其余各組在轉(zhuǎn)染后,用含35.6mM葡萄糖的DMEM繼續(xù)

2、培養(yǎng)48h,然后檢測以下指標(biāo):①細(xì)胞存活率；②HUVECs中AE2 mRNA的表達(dá)；③HUVECs中AE2蛋白的表達(dá):④細(xì)胞凋亡的程度；⑤細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)的含量；⑥細(xì)胞中Caspase-3活性；⑦HUVECs中線粒體膜電位變化；⑧細(xì)胞內(nèi)NO水平。
　　 結(jié)果:HUVECs用高糖培養(yǎng)48h后,細(xì)胞存活率明顯下降,AE2 mRNA和蛋白表達(dá)水平升高,與Control組相比具有顯著性差異(P<0.01)；Caspase-3激活增

3、多,ROS含量增加,NO水平和線粒體膜電位下降,細(xì)胞明顯凋亡,與Control組比較具有顯著性差異(P<0.05)。HUVECs先轉(zhuǎn)入AE2 shRNA干擾質(zhì)粒,再用高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)48h后,細(xì)胞的存活率較單純用高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞明顯上升,AE2 mRNA和蛋白表達(dá)水平也相應(yīng)地明顯下降,與高糖組比較具有顯著性差異(P<0.01):Caspase-3激活明顯減少,NO下降不明顯,ROS含量降低,線粒體膜電位升高,細(xì)胞凋亡明顯減輕,與高

4、糖組比較具有顯著性差異(P<0.05)。而轉(zhuǎn)入非特異shRNA用高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)48h后,以上所對應(yīng)的指標(biāo)并沒有發(fā)生顯著性變化,與高糖組比較沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。以上結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)成功地將AE2基因特異性沉默后,有效地降低了高糖所致ROS的生成,并且阻止了線粒體膜電位的下降及Caspase-3的激活,明顯防止了高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷和凋亡。
　　 結(jié)論:AE2可介導(dǎo)高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷或/和凋亡,其機(jī)制可能與ROS/mPT