COX-2在香煙提取物誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中的作用.pdf

1、目的：探討環(huán)氧合酶2(Cyclooxygenase 2，COX-2)對(duì)于香煙提取物(Cigarette Smoking Extract，CSE)所誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響。 方法：體外培養(yǎng)人血管內(nèi)皮細(xì)胞株(ECV-304)，取指數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。一支去過濾嘴燃燒的香煙由負(fù)壓吸引驅(qū)動(dòng)裝置連續(xù)抽吸，吸入煙霧，經(jīng)三通管的一個(gè)出口入無(wú)血清1640培養(yǎng)液中制成懸液，過濾除菌，并稀釋成含不同濃度CSE的1640培養(yǎng)基，1 h內(nèi)用于實(shí)驗(yàn)。

2、整個(gè)實(shí)驗(yàn)分為三個(gè)部分：1.內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)，按照CSE的干預(yù)濃度不同，將實(shí)驗(yàn)分成四組，即對(duì)照組、0.5％CSE干預(yù)組、1％CSE干預(yù)組、5％CSE干預(yù)組。各組細(xì)胞培養(yǎng)12h后，采用Hoechst染色法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況，免疫細(xì)胞化學(xué)和Western Blot法檢測(cè)COX-2的蛋白表達(dá)。2.根據(jù)上一步實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，選取5％CSE為干預(yù)點(diǎn)，分別干預(yù)血管內(nèi)皮細(xì)胞0小時(shí)、3小時(shí)、6小時(shí)、9小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)后，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞

3、的凋亡情況，Western Blot法檢測(cè)COX-2的蛋白表達(dá)。3.綜合前兩步實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，用5％CSE和不同濃度的選擇性COX-2抑制劑塞萊西布(celecoxib)，共同干預(yù)內(nèi)皮細(xì)胞。根據(jù)塞萊西布的干預(yù)濃度不同，將實(shí)驗(yàn)分為七組，即對(duì)照組(0％CSE)、5％CSE干預(yù)組、5％CSE+2.5μM/L塞萊西布干預(yù)組、5％CSE+5pM/L塞萊西布干預(yù)組、5％CSE+10μM/L塞萊西布干預(yù)組、5％CSE+20μM/L塞萊西布干預(yù)組、5％CS

4、E+50μM/L塞萊西布干預(yù)組。各組干預(yù)9小時(shí)后，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，Western Blot法檢測(cè)COX-2的蛋白表達(dá)。 結(jié)果：(1)不同濃度的CSE分別干預(yù)內(nèi)皮細(xì)胞12小時(shí)后，Hoechst染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果為，對(duì)照組(6.5±0.54％)，干預(yù)組結(jié)果分別為(7.6±0.41％)、(13.5±1.78％)、(32.3±3.22％)，0.5％CSE干預(yù)組與對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，余各組間均存在統(tǒng)計(jì)

5、學(xué)差異(P值均<0.05)；流式細(xì)胞術(shù)測(cè)得細(xì)胞凋亡率為，對(duì)照組(1.61±0.24％)，干預(yù)組結(jié)果分別為(2.01±0.36％)、(2.31±0.26％)、(5.40±0.39％)，各組間比較，均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P值均<0.05)；Western Blot檢測(cè)COX-2表達(dá)結(jié)果顯示，隨著CSE干預(yù)濃度的升高，COX-2的表達(dá)逐漸增強(qiáng)，5％CSE干預(yù)后COX-2蛋白的表達(dá)最高。(2)5％CSE作用于內(nèi)皮細(xì)胞不同時(shí)間后，流式細(xì)胞術(shù)測(cè)得各組細(xì)

6、胞凋亡率為，對(duì)照組(1.73±0.16％)、各干預(yù)組分別為(2.69±0.28％)、(2.86±0.15％)、(3.66±0.40％)、(5.39±0.57％)、(8.87±0.41％)。3小時(shí)組和6小時(shí)組比較，結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，余各組間比較均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P值均<0.05)。Western Blot檢測(cè)COX-2表達(dá)結(jié)果顯示，隨著5％CSE干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)，COX-2的表達(dá)逐漸增強(qiáng)。干預(yù)3小時(shí)的時(shí)侯COX-2蛋白的表達(dá)

7、開始增加，9小時(shí)達(dá)峰，12小時(shí)開始逐漸減弱，24小時(shí)時(shí)明顯消失。(3)5％CSE與不同濃度的選擇性COX-2抑制劑塞萊西布共同作用于內(nèi)皮細(xì)胞9小時(shí)后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率結(jié)果顯示對(duì)照組為(1.78±0.21％)，各十預(yù)組分別為(3.90±0.27％)、(3.56±0.39％)、(3.13±0.38％)、(2.92±0.21％)、(4.69±0.50％)、(32.60±5.51％)。其中5％CSE+50μM/L塞萊西布干預(yù)組與其余

8、各組比較，內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率顯著增高，結(jié)果存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P值均<0.05)，余各組間比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P值均>0.05)。Western Blot檢測(cè)COX-2表達(dá)結(jié)果顯示，隨著塞萊西布干預(yù)濃度的升高，COX-2的表達(dá)逐漸減弱。 結(jié)論：(1)CSE可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡甚至死亡，且存在濃度依賴性和時(shí)間依賴性。(2)CSE能夠誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞分泌COX-2蛋白，而且存在濃度依賴性和時(shí)間依賴性。(3)選擇性的COX-2抑制劑塞萊西布，可