血紅素氧合酶-1基因?qū)Ω咛羌安▌?dòng)性高糖誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、目的:
　　觀察血紅素氧合酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)基因?qū)Ω咛呛筒▌?dòng)性高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)凋亡及凋亡相關(guān)基因bax、bcl-2表達(dá)的影響,為基因治療糖尿病血管病變提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。
　　方法:
　　1.體外培養(yǎng)未轉(zhuǎn)染HUVECs及轉(zhuǎn)染HO-1基因的HUVECs(轉(zhuǎn)染HUVECs)。
　　

2、2.應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)( reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)檢測(cè)轉(zhuǎn)染HUVECs HO-1基因mRNA的表達(dá)。
　　3.以體外培養(yǎng)成功的未轉(zhuǎn)染HUVECs及轉(zhuǎn)染HUVECs為研究對(duì)象,研究HO-1基因?qū)Ω咛呛筒▌?dòng)性高糖誘導(dǎo)的HUVECs凋亡及凋亡相關(guān)基因bax、bcl-2表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)分6組:正常葡萄糖組(未轉(zhuǎn)染HUVECs+含5.5mmol/L D

3、-葡萄糖)、穩(wěn)定性高糖組(未轉(zhuǎn)染HUVECs+含20.0mmol/L D-葡萄糖)、波動(dòng)性高糖組(未轉(zhuǎn)染HUVECs+含每24小時(shí)輪換加入5.5mmol/L或20.0mmol/L D-葡萄糖)、正常葡萄糖/HO-1組(轉(zhuǎn)染后HUVECs+含5.5mmol/L D-葡萄糖)、穩(wěn)定性高糖/HO-1組(轉(zhuǎn)染后HUVECs+含20.0mmol/L D-葡萄糖)與波動(dòng)性高糖/HO-1組(轉(zhuǎn)染后HUVECs+含每24小時(shí)輪換5.5mmol/L或20

4、.0mmol/L D-葡萄糖)。各組細(xì)胞在37℃,5％CO2條件下培養(yǎng)7天。應(yīng)用噻唑藍(lán)(MTT)方法測(cè)定HUVECs細(xì)胞存活率;應(yīng)用吖啶橙/溴乙啶(AO/EB)染色法檢測(cè)HUVECs細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)改變;應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)凋亡相關(guān)基因bax、bcl-2mRNA的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.HO-1基因mRNA在轉(zhuǎn)染HUVECs的表達(dá)
　　RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示:HO-1mRNA在未轉(zhuǎn)染HUVECs的表達(dá)量很低,而在轉(zhuǎn)

5、染HUVECs的表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。
　　2.高糖和波動(dòng)性高糖對(duì)HUVECs存活率的影響
　　HUVECs在高糖和波動(dòng)性高糖環(huán)境培養(yǎng)7天后,采用MTT方法測(cè)定HUVECs存活率。檢測(cè)結(jié)果顯示:穩(wěn)定性高糖組與波動(dòng)性高糖組HUVECs存活率下降,分別為正常葡萄糖組的79%(P<0.05)和59%(P<0.001),且波動(dòng)性高糖組HUVECs存活率低于穩(wěn)定性高糖組(P<0.05)。
　　3.高糖和波動(dòng)性高糖對(duì)HU

6、VECs凋亡的影響
　　HUVECs在高糖和波動(dòng)性高糖環(huán)境培養(yǎng)7天后,AO/EB染色檢測(cè)結(jié)果顯示:穩(wěn)定性高糖組與波動(dòng)性高糖組HUVECs凋亡細(xì)胞數(shù)明顯上升,分別為正常葡萄糖組的1.61倍(P<0.001)和1.79倍(P<0.001),且波動(dòng)性高糖組HUVECs凋亡細(xì)胞數(shù)高于穩(wěn)定性高糖組(P<0.05)。
　　4.高糖和波動(dòng)性高糖對(duì)凋亡基因bax、bcl-2mRNA表達(dá)的影響
　　HUVECs在高糖和波動(dòng)性高糖環(huán)境培養(yǎng)

7、7天后,提取細(xì)胞總RNA,RT-PCR檢測(cè)bax、bcl-2 mRNA表達(dá)。檢測(cè)結(jié)果顯示:與正常葡萄糖組相比,穩(wěn)定性高糖組與波動(dòng)性高糖組bcl-2mRNA表達(dá)顯著減弱(P<0.05,P<0.001),且波動(dòng)性高糖組bcl-2mRNA的表達(dá)較高糖組減弱更為顯著(P<0.05)。baxmRNA的表達(dá)無(wú)明顯變化,差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　5.HO-1基因?qū)UVECs存活率的影響
　　轉(zhuǎn)染HUVECs與未轉(zhuǎn)染HUV

8、ECs在高糖和波動(dòng)性波動(dòng)性高糖環(huán)境培養(yǎng)7天后,MTT方法測(cè)定HUVECs存活率。檢測(cè)結(jié)果顯示:與穩(wěn)定性高糖組和波動(dòng)性高糖組相比,穩(wěn)定性高糖/HO-1組與波動(dòng)性高糖/HO-1組HUVECs存活率升高。穩(wěn)定性高糖/HO-1組為穩(wěn)定性高糖組的1.37倍(P<0.05);波動(dòng)性高糖/HO-1組為波動(dòng)性高糖組的1.47倍(P<0.05)。
　　6.HO-1基因?qū)Ω咛呛筒▌?dòng)性高糖誘導(dǎo)的HUVECs凋亡的作用
　　轉(zhuǎn)染HUVECs與未轉(zhuǎn)染

9、HUVECs在高糖和波動(dòng)性高糖環(huán)境培養(yǎng)7天后,AO/EB染色檢測(cè)結(jié)果顯示:與穩(wěn)定性高糖組和波動(dòng)性高糖組相比,穩(wěn)定性高糖/HO-1組與波動(dòng)性高糖/HO-1組 HUVECs凋亡細(xì)胞數(shù)明顯下降,穩(wěn)定性高糖/HO-1組為穩(wěn)定性高糖組的67%(P<0.001);波動(dòng)性高糖/HO-1組為波動(dòng)性高糖組的81%(P<0.001)。
　　7. HO-1基因?qū)Φ蛲龌騜ax、bcl-2mRNA表達(dá)的影響
　　轉(zhuǎn)染HUVECs與未轉(zhuǎn)染HUVECs

10、在高糖和波動(dòng)性高糖環(huán)境培養(yǎng)7天后,提取細(xì)胞總RNA, RT-PCR檢測(cè)bax、bcl-2mRNA表達(dá)。結(jié)果顯示:與穩(wěn)定性高糖組與波動(dòng)性高糖組相比,穩(wěn)定性高糖/HO-1組、波動(dòng)性高糖/HO-1組bcl-2mRNA表達(dá)增強(qiáng)(P<0.05)。baxmRNA表達(dá)無(wú)明顯變化(P>0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.高糖和波動(dòng)性高糖均能誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,且波動(dòng)性高糖比穩(wěn)定性高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡程度更為嚴(yán)重,其機(jī)制可能與抗凋亡基因