Chemerin其受體ChemR23對(duì)高糖誘導(dǎo)的腎小球內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的調(diào)控作用.pdf

1、背景：
　　糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)導(dǎo)致終末期腎病（end stage renal disease，ESRD）最為重要的原因之一。腎小球內(nèi)皮細(xì)胞（glomerular endothelial cell，GEnC）是腎小球?yàn)V過(guò)屏障必不可少的組成成分，其對(duì)于限制蛋白尿的產(chǎn)生，維持正常腎功能均具有重要的意義。研究發(fā)現(xiàn)，高糖環(huán)境可誘導(dǎo)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生明顯的炎癥反應(yīng)，引起相應(yīng)的功能障礙

2、。探討內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的發(fā)生原因?qū)N發(fā)病機(jī)制的理解及臨床治療具有重要意義。
　　Chemerin是1997年發(fā)現(xiàn)的一種脂肪因子，在體內(nèi)多種細(xì)胞均有表達(dá)，且與脂質(zhì)代謝、炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)等密切相關(guān)。其分泌入血后具有調(diào)節(jié)全身及局部炎癥反應(yīng)并誘導(dǎo)白細(xì)胞趨化的作用。ChemR23是最主要的識(shí)別Chemerin的受體。研究證實(shí) Chemerin主要通過(guò)ChemR23激活細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)通路，引起下游炎癥因子的轉(zhuǎn)錄，造成組織炎性損傷。但目前為

3、止，二者在DN腎小球內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的作用尚未明確。
　　目的：
　　1.觀察高糖環(huán)境下小鼠腎小球內(nèi)皮細(xì)胞Chemerin、ChemR23及炎癥因子TNF-α、IL-6表達(dá)變化。
　　2.沉默Chemerin受體ChemR23的表達(dá)后應(yīng)用Chemerin刺激細(xì)胞，觀察炎癥因子TNF-α、IL-6的表達(dá)變化。
　　3.沉默Chemerin受體ChemR23的表達(dá)后，觀察高糖誘導(dǎo)下炎癥因子TNF-α、IL-6的表達(dá)

4、變化。
　　4.通過(guò)抑制p38 MAPK的磷酸化，觀察炎癥因子TNF-α、IL-6的表達(dá)變化。
　　方法：
　　以條件永生化小鼠GEnCs為研究對(duì)象
　　1.體外培養(yǎng)小鼠GEnCs并分成四組：正常對(duì)照組（葡萄糖：5.6mmol/L）、20mmol/L高糖組、40mmol/L高糖組、滲透壓對(duì)照組（5.6mmol/L葡萄糖＋34.4mmol/L甘露醇），不同培養(yǎng)基作用24h后進(jìn)行檢測(cè)。Western Blot檢測(cè)細(xì)胞

5、Chemerin、ChemR23、TNF-α、IL-6蛋白的表達(dá)水平，ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中炎癥因子TNF-α、IL-6的表達(dá)水平，qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞Chemerin、ChemR23、TNF-α、IL-6的mRNA表達(dá)水平。
　　2.構(gòu)建針對(duì)ChemR23的慢病毒載體，將慢病毒載體和空載體分別轉(zhuǎn)染入小鼠GEnCs后，給予Chemerin刺激，共分為四組：正常對(duì)照組、Chemerin刺激組、Chemerin＋空載體組、Ch

6、emerin＋shRNA干擾組。培養(yǎng)一定時(shí)間后進(jìn)行檢測(cè)。Western Blot檢測(cè)ChemR23蛋白表達(dá)水平，ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清炎癥因子TNF-α、IL-6的表達(dá)水平，qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞TNF-α、IL-6的mRNA表達(dá)水平。
　　3.將慢病毒載體和空載體分別轉(zhuǎn)染入高糖下培養(yǎng)的小鼠GEnCs，共分為四組：正常對(duì)照組、高糖組、高糖＋空載體組、高糖＋shRNA干擾組。培養(yǎng)一定時(shí)間后進(jìn)行檢測(cè)。ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清炎癥

7、因子TNF-α、IL-6的表達(dá)水平，qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞TNF-α、IL-6的mRNA表達(dá)水平，Western Blot檢測(cè)p38 MAPK、p-p38 MAPK蛋白表達(dá)水平。
　　4.體外培養(yǎng)小鼠GEnCs，高糖刺激前加入p38 MAPK抑制劑SB203580，共分為三組：正常對(duì)照組、高糖組、高糖＋抑制劑組。培養(yǎng)一定時(shí)間后，ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清炎癥因子TNF-α、IL-6的表達(dá)水平，qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞TNF-α、IL

8、-6的mRNA表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1.高糖環(huán)境下小鼠GEnCs中Chemerin、ChemR23及炎癥因子IL-6、TNF-α的表達(dá)變化。
　　與正常對(duì)照相比，高糖組GEnCs中炎癥因子IL-6及TNF-α的表達(dá)顯著升高（P<0.05），同時(shí)Chemerin表達(dá)水平明顯升高（P<0.05），但ChemR23表達(dá)無(wú)明顯變化（P>0.05），滲透壓對(duì)照組均無(wú)改變（P>0.05）。
　　2.慢病毒載體干擾Che

9、mR23表達(dá)后Chemerin作用下小鼠GEnCs中炎癥因子IL-6、TNF-α的表達(dá)變化。
　　使用針對(duì)ChemR23的shRNA慢病毒干擾ChemR23表達(dá)后應(yīng)用 Chemerin刺激細(xì)胞，Chemerin刺激組IL-6及TNF-α表達(dá)明顯升高（P<0.05），與Chemerin+空載體組相比，Chemerin+shRNA干擾組IL-6及TNF-α水平明顯下降（P<0.05）。
　　3.慢病毒載體干擾ChemR23表達(dá)后

10、高糖誘導(dǎo)下小鼠GEnCs中炎癥因子IL-6、TNF-α的表達(dá)變化和p38 MAPK信號(hào)通路的活化情況。
　　干擾ChemR23表達(dá)后，與高糖+空載體組相比，高糖+shRNA干擾組IL-6及TNF-α水平明顯下降（P<0.05）。高糖組p38 MAPK磷酸化水平明顯升高（P<0.05），提示p38 MAPK活化增強(qiáng)。與高糖+空載體組相比，高糖+shRNA干擾組p-p38MAPK水平顯著降低（P<0.05）。
　　4.使用p38

11、 MAPK特異性抑制劑SB203580，小鼠GEnCs中的炎癥因子IL-6、TNF-α的表達(dá)變化。
　　與高糖組相比，高糖+抑制劑組IL-6及TNF-α水平顯著降低（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.高糖刺激可誘導(dǎo)GEnCs合成Chemerin。
　　2.Chemerin通過(guò)結(jié)合其受體ChemR23可引起p38 MAPK信號(hào)通路的活化，從而誘導(dǎo)炎癥因子IL-6及TNF-α等的表達(dá)，促進(jìn)GEnCs的炎癥反應(yīng)。<