硫化氫抑制高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞炎癥的機制.pdf

1、[研究背景]糖尿病血管病變是糖尿病患者致死、致殘的主要原因之一。血管內(nèi)皮的炎癥反應(yīng)在血管病變的發(fā)生、發(fā)展中扮演著重要角色。糖尿病被認為是一種低度炎癥性疾病，高糖毒性引起的血管內(nèi)皮炎癥是糖尿病血管病變發(fā)生的重要機制。以往研究證實，細胞間粘附分子-1(ICAM-1)及環(huán)氧化酶-2(COX-2)作為炎性因子與心血管疾病等的發(fā)病過程密切相關(guān)。硫化氫作為一種新型的氣體信號分子，在原發(fā)性高血壓、失血性休克、心肌梗死等心血管疾病中起保護作用。當(dāng)前研究

2、表明，硫化氫具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，如抑制心肌損傷、影響細胞凋亡及細胞增殖過程以及調(diào)節(jié)胰島素釋放等，這都與其抑制炎癥反應(yīng)的作用密不可分。但硫化氫在糖尿病血管病變發(fā)病過程中的作用目前尚不十分明確?；谏鲜鲅芯楷F(xiàn)狀，為了更深入得探討硫化氫與高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞炎癥的關(guān)系，以便為糖尿病血管病變的靶向治療提供新的實驗依據(jù)，我們開展了相關(guān)研究。本研究確定的研究目的及方法如下:
　　 [目的]
　　 1.通過外源性硫化氫處理人臍靜脈內(nèi)皮

3、細胞，觀察硫化氫對炎癥因子ICAM-1、COX-2蛋白及mRNA表達的影響，探討硫化氫對炎癥相關(guān)指標的作用。
　　 2.觀察硫化氫對NF-κB核轉(zhuǎn)移及NF-κB-DNA結(jié)合活性的影響，探討硫化氫抑制炎癥反應(yīng)的機制。
　　 [方法]
　　 1.采用0.125％胰酶和0.01％EDTA灌注法獲得人臍靜脈內(nèi)皮細胞原代，置于含10％胎牛血清的M199培養(yǎng)基中，放于37℃、5％CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第2、3代細胞用于實

4、驗。當(dāng)細胞融合度達70％-80％時，換成含2％胎牛血清的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。
　　 (1)將細胞分為6組:正常糖濃度組（5.5mmol/L葡萄糖）、高糖組(16.7mmol/L葡萄糖)、高糖+25μmol/L硫氫化鈉組、高糖+50μmol/L硫氫化鈉組、高糖+100μmol/L硫氫化鈉組、正常糖濃度+100μmol/L硫氫化鈉組，為保證各組滲透壓一致，用甘露醇平衡正常組及正常+硫氫化鈉組的滲透壓。培養(yǎng)相應(yīng)時間后，測定細胞內(nèi)RelA

5、/NF-κBp65的活性以及ICAM-1的表達。
　　 (2)將TNF-α處理后的細胞分為6組:正常組、10ng/mlTNF-α組、TNF-α+5μmol/L乙酰半胱氨酸(NAC)組、TNF-α+25μmol/L硫氫化鈉組、TNF-α+50μmol/L硫氫化鈉組、TNF-α+100μmol/L硫氫化鈉組。培養(yǎng)相應(yīng)時間后，測定細胞內(nèi)ICAM-1的表達。
　　 2.將人臍靜脈內(nèi)皮細胞株接種于DMEM完全培養(yǎng)基中，置于37℃、

6、5％CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細胞融合度達70％-80％時，換成含2％胎牛血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，同時將細胞分為4組:正常糖濃度組（5.5mmol/L葡萄糖）、高糖組（16.7mmol/L葡萄糖）、高糖+100μmol/L硫氫化鈉組、正常糖濃度+100μmol/L硫氫化鈉組，為保證各組滲透壓一致，用甘露醇平衡正常組及正常+硫氫化鈉組的滲透壓。培養(yǎng)相應(yīng)時間后，測定細胞內(nèi)RelA/NF-κBp65的活性以及COX-2的表達。
　　

7、[結(jié)果]
　　 (1)與正常組相比，高糖處理48h和72h時ICAM-1的蛋白表達顯著增加(p＜0.01)。
　　 (2)與正常組相比，高糖組ICAM-1蛋白(p＜0.01)及mRNA(p＜0.05)的表達量顯著增加，硫氫化鈉可以劑量依賴性的抑制其表達的增加。
　　 (3)與正常組相比，高糖組COX-2蛋白(p＜0.01)及mRNA(p＜0.01)的表達量顯著增加，100μmol/L硫氫化鈉可以抑制其表達的增加。

8、
　　 (4)與正常組相比，TNF-α處理組的ICAM-1蛋白表達量顯著增加(p＜0.01)，硫氫化鈉及乙酰半胱氨酸(NAC)可以抑制其表達的增加。
　　 (5)與正常組相比，高糖組p-IκBα/IκBα比值顯著增加(p＜0.01)，硫氫化鈉可以劑量依賴性的抑制其比值的增加。
　　 (6)與正常組相比，高糖可促進RelA/p65向核內(nèi)轉(zhuǎn)移，100μmol/L硫氫化鈉可以抑制其轉(zhuǎn)移。
　　 (7)與正常組相