甲基雙加氧酶2在高糖刺激腎小球系膜細胞TGF-β1表達中的作用研究.pdf

1、糖尿病腎病(DN)是糖尿病最嚴重的并發(fā)癥之一，目前研究發(fā)現(xiàn)有大約40％以上的糖尿病患者同時患有糖尿病腎病，它同時也是引起終末期腎功能衰竭(ESRF)最主要的病因。大量國內(nèi)外的研究提示，高血糖可以通過多種途徑和機制導致糖尿病腎病的發(fā)生和發(fā)展。近年來，表觀遺傳學逐漸被人們所認識，即在不改變DNA序列的前提下發(fā)生的可遺傳和逆轉(zhuǎn)的改變。表觀遺傳學的理論能夠解釋高血糖對糖尿病并發(fā)癥風險的持續(xù)性效果，目前這種現(xiàn)象被稱為“代謝記憶”現(xiàn)象。 DNA甲基

2、化作為表觀遺傳學的重要機制之一，在基因表觀遺傳修飾及表達調(diào)控中發(fā)揮著關鍵性的作用，其中甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)家族(DNMT1、3A、3B)參與DNA的被動去甲基化，而甲基雙加氧酶(TETs)家族(TET1、TET2、TET3)參與DNA的主動去甲基化。
　　目的：
　　本文擬通過動態(tài)觀察在高糖刺激下人腎小球系膜細胞(HMCs)，DNA甲基化相關酶類甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT1、3A、3B)、甲基雙加氧酶(TET1～3)的表達變化

3、，然后通過體內(nèi)和體外實驗分別觀察甲基雙加氧酶TET2與轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)表達變化及其CpG島的甲基化狀態(tài)的相互關系，還包括系膜細胞表型轉(zhuǎn)化相關分子α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)和細胞增殖情況。隨后，通過shRNA特異性干擾人腎小球系膜細胞TET2的表達，及通過(多聚ADP核糖聚合酶)PARP抑制劑PJ-34飼喂db/db小鼠抑制TET2的表達觀察相應TGF-β1表達變化及其CpG島的甲基化狀態(tài)以及系膜細胞表型轉(zhuǎn)化相關分子

4、α-SMA和細胞增殖情況，從而探討TET2在高糖誘導TGF-β1表達激活及高糖誘導系膜細胞表型轉(zhuǎn)化中的作用。
　　方法：
　　1.將體外培養(yǎng)的人腎小球系膜細胞(HMCs)按照培養(yǎng)基的葡萄糖濃度隨機分為五組:低糖正常對照組(NG，5.5 mmol/L葡萄糖)、高糖組（HG，30 mmol/L葡萄糖），其中高糖組分別培養(yǎng)12h-72h:高糖12h組(HG-12h)、高糖24h組(HG-24h)、高糖48h組(HG-48h、高糖7

5、2h組(HG-72h)。
　　2.通過shRNA干擾高糖培養(yǎng)下TET2在系膜細胞中的表達，分為空白對照組(controlB)、轉(zhuǎn)染試劑對照組(control M)、陰性對照組(control N)、shRNA干擾組(shRNA)。
　　3.雌性C57BLKS/J小鼠共20只，其中7周齡db/db小鼠5只、11周齡db/db小鼠及db/m小鼠各5只、15周齡db/db小鼠5只。分別適應性喂養(yǎng)一周，隨后進行試驗，分為4組，每組5

6、只小鼠:db/m組:12周齡db/m小鼠、db/db-8w組:8周齡db/db小鼠、db/db-12w組:12周齡db/db小鼠、db/db-16w組:16周齡db/db小鼠。
　　4.4周齡雌性C57BLKS/J小鼠共15只，其中db/db小鼠10只，db/m小鼠5只;分別適應性喂養(yǎng)一周，隨后進行試驗，其中db/db小鼠以完全隨機的方法分別分為:db/db對照組和db/db+PJ-34組。將PARP抑制劑PJ-34用蒸餾水溶解至

7、2.4 g/l，并加適量阿斯巴甜便于飼喂，以每天每公斤體重30mg的量定時飼喂db/db+PJ-34組，其余db/m對照組和db/db對照組以等量含阿巴斯甜的蒸餾水飼喂至16周齡。
　　5.分別通過實時熒光定量PCR和Western blotting檢測TGF-β1、DNMT1、3A、3B、TET1～3和α-SMA的mRNA和蛋白表達。
　　6.通過亞硫酸氫鈉測序法(BSP)檢測TGF-β1基因CpG島的甲基化狀態(tài)。

8、　　7.腎小球系膜細胞增殖通過噻唑藍比色法(MTT)檢測。
　　8.通過免疫組化檢測小鼠腎臟皮質(zhì)中α-SMA的表達變化。
　　9.通過(過碘酸雪夫染色)PAS染色觀察小鼠腎臟皮質(zhì)中腎小球的病理變化。
　　結(jié)果：
　　1.高糖刺激培養(yǎng)人系膜細胞TGF-β1表達上調(diào)，同時誘導TGF-β1基因CpG島出現(xiàn)去甲基化改變。
　　用高糖培養(yǎng)人系膜細胞，觀察TGF-β1表達變化、TGFβ基因表達調(diào)控區(qū)甲基化變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)

9、，與對照組相比較，高糖培養(yǎng)24h后，系膜細胞TGF-β1的mRNA及蛋白表達均顯著增加，并存在時間依賴效應。同時發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，高糖培養(yǎng)24h后系膜細胞TGF-β1第一外顯子區(qū)CpG島的四個CG位點出現(xiàn)明顯的去甲基化改變。
　　2.高糖培養(yǎng)可誘導人系膜細胞TET2表達上調(diào)。
　　我們進一步研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，高糖培養(yǎng)12h后，參與主動去甲基化的TET2出現(xiàn)明顯的表達上調(diào)，且存在時間依賴效應，這與高糖誘導TGF-β1基

10、因CpG島去甲基化改變相一致。TET1、TET3以及DNMT1、DNMT3A表達未見明顯改變。
　　3.應用shRNA特異性干擾TET2的表達，可逆轉(zhuǎn)高糖誘導的人系膜細胞TGF-β1基因CpG島所發(fā)生的去甲基化及其高表達。
　　與對照組比較，shRNA可顯著抑制一般培養(yǎng)條件下系膜細胞TET2的mRNA及蛋白表達。同時發(fā)現(xiàn)，shRNA也可顯著下調(diào)高糖誘導的系膜細胞TGF-β1的基因及蛋白表達。甲基化檢測發(fā)現(xiàn)，shRNA處理后，

11、高糖誘導的TGF-β1基因調(diào)控區(qū)CpG島去甲基化可被顯著逆轉(zhuǎn)。
　　4.進一步研究證實，應用shRNA特異性干擾TET2的表達后，高糖誘導下的系膜細胞α-SMA表達升高和系膜細胞的顯著增殖也被抑制。
　　5.隨著db/db小鼠糖尿病腎病的發(fā)生和進展，腎皮質(zhì)中TET2和TGFβ1的表達水平均逐步升高，TGF-β1基因調(diào)控區(qū)CpG島出現(xiàn)明顯的去甲基化改變。
　　我們進一步觀察了不同周齡的db/db小鼠腎臟皮質(zhì)中TGF-β1

12、的表達改變發(fā)現(xiàn):與db/m對照組小鼠比較，腎臟皮質(zhì)TGF-β1的mRNA及蛋白表達均出現(xiàn)明顯地進行性上調(diào)。BSP測序發(fā)現(xiàn)，與db/m對照組比較，從8周齡到16周齡的db/db小鼠，TGF-β1啟動子區(qū)及第一外顯子區(qū)的四個位點出現(xiàn)持續(xù)的去甲基化改變。為此，我們進一步研究了DNA甲基化相關酶在db/db小鼠腎臟皮質(zhì)中的表達變化，我們發(fā)現(xiàn):與db/m對照組比較，隨著周齡的增長，腎臟皮質(zhì)TET2及DNMT3B的mRNA及蛋白表達均出現(xiàn)明顯地上調(diào)

13、，但TET1、TET3、DNMT1、DNMT3A未見明顯表達改變。
　　6.PJ-34抑制TET2的表達，不僅使db/db小鼠腎皮質(zhì)TGFβ1基因調(diào)控區(qū)CpG島去甲基化被逆轉(zhuǎn)，也使TGF-β1基因表達水平下調(diào)。
　　為了進一步證明在體情況下TET2-TGFβ基因調(diào)控區(qū)CpG島甲基化變化-TGFβ表達變化三者之間的調(diào)控關系，我們應用PARP抑制劑PJ-34飼喂抑制TET2的表達后，與db/db對照組比較，發(fā)現(xiàn)db/db+PJ-

14、34組TGFβ1啟動子區(qū)及第一外顯子區(qū)上四個位點的甲基化率明顯升高，與此同時，TGF-β1的mRNA及蛋白表達也出現(xiàn)明顯地下調(diào)。
　　7.抑制db/db小鼠腎皮質(zhì)中TET2的表達后，db/db小鼠腎小球系膜細胞增殖及α-SMA的合成也被顯著抑制。
　　我們通過PAS染色觀察腎臟的病理改變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與db/db對照組相比較，db/db+PJ-34組腎小球肥大、系膜基質(zhì)、系膜區(qū)面積、毛細血管基底膜厚度等病理改變均明顯減輕。通過