調(diào)控JAK2-STAT通路的表達(dá)對(duì)高糖狀態(tài)下腎小球系膜細(xì)胞保護(hù)作用的研究.pdf

1、糖尿病腎病(Diabetic Nephropathy,DN)是導(dǎo)致終末期腎衰的主要原因之一,進(jìn)一步明確糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制,延緩其病情進(jìn)展是目前亟待解決的問(wèn)題。我們先前的研究表明,高糖誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞增生過(guò)度(GlomerularMesangial Cells,GMC),分泌轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growthfactot-β1,TGF-β1),結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth f

2、actor,CTGF),促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)沉積,從而導(dǎo)致腎臟纖維化,是糖尿病腎病的基本特點(diǎn)。
　　 酪氨酸蛋白激酶2/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子(activation of Janus kinase2/signal.transducers and activators of transcription,JAK2/STAT)通路在糖尿病腎病發(fā)病過(guò)程中的作用一直是研究的熱點(diǎn),抑制JAK2-STAT通路激活的有害作用對(duì)于治療糖尿病合并癥尤其糖尿

3、病腎病意義重大,普羅布考是一種降血脂藥物,同時(shí)具有抗氧化功能,在與免疫性疾病相關(guān)系統(tǒng)疾病的治療中也具有強(qiáng)大的作用,但其作用機(jī)理仍有待進(jìn)一步研究。值得注意的是:通過(guò)干擾素γ(IFN-γ)誘導(dǎo)的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用需要激活STAT1,即IFN-γ的抗增殖活性通過(guò)STAT1的激活而加強(qiáng),而如果抑制STAT1磷酸化可使其抗增殖活性減弱。STAT1可能是一個(gè)關(guān)鍵的保護(hù)因子,并將成為今后治療糖尿病腎病的一個(gè)新的靶點(diǎn)。
　　 我們研究不同糖濃度下

4、人腎小球系膜細(xì)胞(Hunlan Mesangial Cells,HMC)增殖和分泌促纖維化因子的變化,不同糖濃度下人腎小球系膜細(xì)胞內(nèi)JAK2/STAT通路的激活狀況;并研究普羅布考和IFN-γ對(duì)JAK2/STAT通路的調(diào)控作用和進(jìn)一步對(duì)高糖狀態(tài)下人腎小球系膜細(xì)胞的增殖狀況和分泌促纖維化因子變化的影響。
　　 方法：
　　 1、高糖狀態(tài)下腎小球系膜細(xì)胞JAK2/STAT通路表達(dá)變化及作用的研究體外培養(yǎng)人腎小球系膜細(xì)胞,第3

5、-6代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為3組:正常糖濃度組(NG,5.5mmol/L葡萄糖),對(duì)照組(NG+19.5mmol/L甘露醇),高糖濃度組(HG,25 mmol/L葡萄糖),刺激時(shí)間為48小時(shí)。應(yīng)用MTT方法檢測(cè)在刺激48小時(shí)后各組細(xì)胞增殖狀況;并在48小時(shí)刺激結(jié)束后分別收取各組細(xì)胞,提取mRNA,進(jìn)行RT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TGF-β1mRNA以及CTGFmRNA水平;提取總蛋白,進(jìn)行Western-b1ot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TGF-β1、CTGF蛋

6、白變化情況,檢測(cè)JAK2、P-JAK2、STAT1、P-STAT1、STAT3、P-STAT3蛋白變化情況。
　　 2、JAK2/STAT通路抑制調(diào)節(jié)普羅布考對(duì)高糖狀態(tài)下腎小球系膜細(xì)胞保護(hù)作用的研究體外培養(yǎng)人腎小球系膜細(xì)胞,第3-6代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為6組:正常糖濃度組(NG,5.5mmol/L葡萄糖),高糖濃度組(HG,25 mmol/L葡萄糖),以及高糖添加不同濃度普羅布考(25μ mol/L,50μmol/L,75μ

7、mol/L,100μ mol/L)藥物組,刺激時(shí)間為48小時(shí)。首先應(yīng)用MTT方法分別檢測(cè)在刺激結(jié)束后各組細(xì)胞增殖狀況,篩選出合適的普羅布考藥物濃度；之后按照篩選后的實(shí)驗(yàn)分組在48小時(shí)刺激結(jié)束后分別收取各組細(xì)胞,提取mRNA,進(jìn)行RT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TGF-β1mRNA以及CTGFmRNA水平；提取總蛋白,進(jìn)行Western-blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TGF-β1、CTGF蛋白變化情況,檢測(cè)JAK2、P-JAK2、STAT1、P-STAT1、STA

8、T3、P-STAT3蛋白變化情況。
　　 3、激活JAK2/STAT1通路保護(hù)高糖狀態(tài)下腎小球系膜細(xì)胞的研究體外培養(yǎng)人腎小球系膜細(xì)胞,第3-6代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為6組:正常糖濃度組(NG,5.5mmol/L葡萄糖),高糖濃度組(HG,25mmol/L葡萄糖),高糖添加不同濃度IFN-γ(10U/ml,100U/ml,500U/ml)藥物組,HG+100U/ml IFN-γ+50μ mol/l氟達(dá)拉濱組,刺激時(shí)間為48小時(shí)。首

9、先應(yīng)用MTT方法分別檢測(cè)在刺激結(jié)束后各組細(xì)胞增殖狀況,篩選出合適的IFN-γ藥物濃度；之后按照篩選后的實(shí)驗(yàn)分組在48小時(shí)刺激結(jié)束后分別收取各組細(xì)胞,提取mRNA,進(jìn)行RT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TGF-β1mRNA以及CTGFmRNA水平；提取總蛋白,進(jìn)行Western-blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TGF-β1、CTGF蛋白變化情況,檢測(cè)JAK2、P-JAK2、STAT1、P-STAT1蛋白變化情況。
　　 結(jié)果：
　　 1、高糖狀態(tài)下腎小

10、球系膜細(xì)胞JAK2/STAT通路表達(dá)變化及作用的研究刺激48小時(shí)后,與NG組和對(duì)照組相比,HG組P-JAK2、P-STAT1、P-STAT3蛋白表達(dá)增加,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。JAK2、STAT1、STAT3蛋白表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。NG組與對(duì)照組JAK2、STAT1、sTAT3、P-JAK2、P-STAT1、P-STAT3蛋白表達(dá)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與NG組和對(duì)照組相比,HG組人系膜細(xì)胞增殖增加,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;NG組與對(duì)照組系膜細(xì)胞增殖無(wú)明顯差異。與

11、NG組和對(duì)照組相比,HG組TGF-β1mRNA以及CTGFmRNA水平增高,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,NG組與對(duì)照組無(wú)明顯差異。刺激48小時(shí)比較與NG組和對(duì)照組相比,HG組TGF-β1以及CTGF蛋白表達(dá)增加,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,NG組與對(duì)照組無(wú)明顯差異。
　　 2、JAK2/STAT通路調(diào)節(jié)普羅布考對(duì)高糖狀態(tài)下腎小球系膜細(xì)胞保護(hù)作用的研究刺激48小時(shí)后,與NG組相比,HG組P-JAK2、P-STAT1、P-STAT3蛋白表達(dá)增加,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,

12、JAK2、STAT1、STAT3蛋白表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。高糖添加普羅布考(50μ mol/L,75μ mol/L,100μmol/L)藥物組與HG組對(duì)比,P-JAK2、P-STAT1、P-STAT3蛋白表達(dá)減少,JAK2、STAT1、STAT3蛋白表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與NG組相比,HG組人系膜細(xì)胞增殖增加,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。高糖添加普羅布考(50μ mol/L,75μ mol/L,100μ mol/L)藥物組與HG組對(duì)比,系膜細(xì)胞增殖減少,有統(tǒng)

13、計(jì)學(xué)意義,且與普羅布考濃度呈正相關(guān);其中75μ mol/L以及100μ mol/L普羅布考顯示對(duì)細(xì)胞增殖過(guò)度抑制。HG組TGF-β1mRNA以及CTGFmRNA水平增高,高糖添加普羅布考(25μ mol/L,50μmol/L)組TGF-β1mRNA以及CTGFmRNA水平減低。HG組TGF-β1以及CTGF蛋白表達(dá)增加,高糖添加普羅布考(25μ mol/L,50μ mol/L)組TGF-β1以及CTGF蛋白表達(dá)減低。
　　 3、

14、激活JAK2/STAT1通路保護(hù)高糖狀態(tài)下腎小球系膜細(xì)胞的研究刺激48小時(shí)后,與NG組相比,HG組P-STAT1、P-JAK2蛋白表達(dá)增加,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,JAK2、STAT1蛋白表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。HG+100U/ml IFN-γ組與HG組對(duì)比,P-STAT1蛋白表達(dá)增加,JAK2、P-JAK2、STAT1蛋白表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,JAK2、P-JAK2、STAT1蛋白表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。HG+1000U/ml IFN-γ+50μ mol/l氟

15、達(dá)拉濱組P-STAT1表達(dá)減少,JAK2、P-JAK2、STAT1蛋白表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與NG組相比,HG組人系膜細(xì)胞增殖增加,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。高糖添加不同濃度IFN-γ(10U/ml,100U/ml,500U/ml)藥物組與HG組對(duì)比,系膜細(xì)胞增殖減少,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,且與IFN-γ濃度呈正相關(guān);其中500U/mlIFN-γ顯示對(duì)細(xì)胞增殖過(guò)度抑制。HG組TGF-β1mRNA以及CTGFmRNA水平增高,高糖添加不同濃度IFN-γ(10U/

16、ml,100U/ml)藥物組rGF-β1mRNA以及CTGFmRNA水平減低。HG組TGF-β1以及CTGF蛋白表達(dá)增加,高糖添加不同濃度IFN-γ(10U/ml,100U/ml)藥物組TGF-β1以及CTGF蛋白表達(dá)減低,HG+100U/ml IFN-γ+50μ mol/l氟達(dá)拉濱組TGF-β1以及CrGF蛋白表達(dá)增加。
　　 結(jié)論
　　 1、高糖狀態(tài)下JAK2/STAT通路激活,人腎小球系膜細(xì)胞增殖增加,分泌促纖維化

17、因子TGF-β1和CTGF增加。
　　 2、普羅布考可抑制高糖狀態(tài)下腎小球系膜細(xì)胞內(nèi)JAK2/STAT通路激活。普羅布考可抑制高糖狀態(tài)下人腎小球系膜細(xì)胞的過(guò)度增殖,抑制高糖引起的腎小球系膜細(xì)胞分泌促纖維化因子TGF-β1和CTGF增加;JAK2/STAT通路的調(diào)節(jié)與普羅布考對(duì)高糖狀態(tài)下腎小球系膜細(xì)胞的保護(hù)相關(guān)。
　　 3、IFN-γ可促進(jìn)高糖狀態(tài)下腎小球系膜細(xì)胞內(nèi)STAT1激活;IFN-γ可抑制高糖狀態(tài)下人腎小球系膜細(xì)胞