Valsartan、Fluvastatin對(duì)高糖培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細(xì)胞PDGF、VEGF表達(dá)影響的研究.pdf

1、目的： 糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)在西方發(fā)達(dá)國家已成為終末期。腎衰竭的首位原因。近年來，我國糖尿病發(fā)病率逐年上升，DN患者也隨之增加，其防治是當(dāng)前腎臟病學(xué)者密切關(guān)注的課題。DN的確切發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚。腎小球系膜細(xì)胞(Glomerular mesangial cell，GMC)是腎小球中最活躍的細(xì)胞，對(duì)于維持腎臟正常組織結(jié)構(gòu)和生理功能發(fā)揮著重要作用，多種腎臟疾病表現(xiàn)出GMC的功能異常。

2、 近年基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化生長因子β(Transforminggrowth factors-β，F(xiàn)GF-β)、血小板衍生生長因子(Platelet-derived growth factor，PDGF)和血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)等可促進(jìn)細(xì)胞增殖及細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)分泌，而DN早期主要是GMC增殖肥大和ECM積聚。已有研究證

3、實(shí)TGF-β參與了DN整個(gè)病理過程，而進(jìn)一步探討PDGF和VEGF與GMC增殖及ECM分泌的關(guān)系，有望更加深入揭示DN的發(fā)病機(jī)制。 高血糖是糖尿病血管并發(fā)癥(包括DN)發(fā)展的高危因素之一，晚近國外研究報(bào)道高糖刺激可通過蛋白激酶C(proteinkinase C，PKC)等途徑激活絲裂原蛋白激酶家族(MAPKs)的一些成員。MAPK也被稱為胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extra cellular signal regulated kina

4、se，ERK)，屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶家族，是細(xì)胞內(nèi)介導(dǎo)胞外刺激的信號(hào)通路之一，哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)存在胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK1/2)、C-jun氨基末端激酶(JNK)、P38MAPK和胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶5(ERK5)。在不同胞外刺激下，相應(yīng)的MAPK通路激活，從而使細(xì)胞對(duì)各種各樣的胞外刺激作出反應(yīng)。有研究證實(shí)激素和生長因子等可通過Ras依賴的信號(hào)通路激活MAPK，然后磷酸化轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)一些生長反應(yīng)基因PDGF、VEGF等的mRNA在

5、MC的異常表達(dá)，最后引起細(xì)胞的增殖和分化，但機(jī)制目前尚未完全闡明。此外，高糖環(huán)境GMC自分泌多種生長因子和細(xì)胞活素，如TGF-β、血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)等的表達(dá)異常也有可能通過某些通路刺激VEGF、PDGF的表達(dá)異常。 PDGF和VEGF都屬于促生長因子，與組織細(xì)胞生長發(fā)育有關(guān)。PDGF是一種主要由血小板分泌產(chǎn)生的重要促細(xì)胞生長因子，VEGF是一種主要作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的絲裂原。有文獻(xiàn)報(bào)道，GMC能合成分泌這兩種細(xì)胞因子，并且存在這

6、兩種細(xì)胞因子的受體。在糖尿病(diabetes.mellitus，DM)患者和動(dòng)物模型中，免疫組化研究證實(shí)PDGF、VEGF在系膜區(qū)表達(dá)增多，而高血糖是DM最基本的生化特性，提示高糖有可能誘導(dǎo)兩種因子在GMC的異常表達(dá)進(jìn)而通過作用于GMC特異性受體發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)并參與DN發(fā)生發(fā)展。 血管緊張素受體拮抗劑(ATlRa)在臨床高血壓的治療當(dāng)中被廣泛應(yīng)用，其主要通過阻止血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)與其受體ATl結(jié)合，抑制了AngⅡ的生

7、物學(xué)作用。有文獻(xiàn)報(bào)道高糖培養(yǎng)的GMC可自分泌Ang Ⅱ，后者和GMC膜上ATl結(jié)合，進(jìn)而導(dǎo)致了GMC內(nèi)PKC等通路的活化，引起其他生長因子基因和蛋白的異常表達(dá)，最終使GMC增殖和分化。HMG-CoA還原酶抑制劑(HRI)，是經(jīng)典有效的降脂藥物，晚近研究提示，HRI可能具有非降脂相關(guān)的腎保護(hù)作用。HRI可通過抑制甲羥戊酸代謝產(chǎn)物FPP、GGpp的合成使依賴其修飾的小GTP蛋白R(shí)as不能定位于細(xì)胞膜，從而抑制細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)。利用ATlRa

8、Valsartan和HRIFluvastatin進(jìn)行干預(yù)，觀察PDGF、VEGF在高糖培養(yǎng)GMC的表達(dá)及藥物的保護(hù)作用能為闡明DN的發(fā)病機(jī)制及尋找防治方法提供實(shí)驗(yàn)性理論依據(jù)。 方法： SD大鼠腎小球系膜細(xì)胞(HBZY--1)，購于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)。貼壁細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞融合后，0.25％胰酶/0.02％EDTA消化傳代，應(yīng)用倒置顯微鏡觀察各時(shí)期細(xì)胞形態(tài)；待細(xì)胞生長達(dá)到一定數(shù)量后，將其隨機(jī)分為五組：

9、即正常對(duì)照組(D-葡萄糖5.5mmol/L，NG組)、甘露醇組(D-葡萄糖5.5mmol/L+甘露醇24.5mmol/L，MG組)、高糖組(D-葡萄糖30 mmol/L，HG組)、高糖+Valsartan干預(yù)組(D-葡萄糖30mmol/L+纈沙坦10μmol/L，HG+val)和高糖+Fluvastatin干預(yù)組(D-葡萄糖30 mmol/L+Fluvastatin 10μmol/L，HG+flu組)分別培養(yǎng)。五組于實(shí)驗(yàn)開始后3、6、2

10、4、48、72h收集細(xì)胞，用逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)法檢測GMC中PDGF、VEGF mRNA的表達(dá)，用westem blot法檢測各實(shí)驗(yàn)組GMC中PDGF、VEGF蛋白的表達(dá)，用ELISA法測定各組細(xì)胞上清ECM中Ⅳ型膠原(collegen type Ⅳ)、層粘連蛋白(laminin，LN)和纖維連接蛋(fibronectin，F(xiàn)N)的含量。 結(jié)果： 1 細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果：倒置相差顯微鏡下可見MC呈梭形、不

11、規(guī)則星形或三角形、樹枝形，當(dāng)細(xì)胞密集時(shí)可重疊生長，胞漿多突起，有大量微絲樣結(jié)構(gòu)，核居中央，多呈圓形或橢圓形； 2 RT-PCR、western blot結(jié)果顯示：高糖環(huán)境中GMC PDGF mRNA和蛋白水平24h時(shí)較NG組升高(P<0.01)，且隨時(shí)間延長表達(dá)量有增高趨勢(P<0.01)，藥物干預(yù)后上述指標(biāo)較HG組表達(dá)水平下降(P<0.01)；同時(shí)間點(diǎn)MG組PDGF mRNA和蛋白水平也較NG組升高((P<0.01)：高糖環(huán)境

12、VEGF mRNA和蛋白水平在3h時(shí)明顯高于NG組(P<0.01)，后逐漸降低，24h時(shí)后于NG組無差別(P>0.05)，藥物干預(yù)后上述指標(biāo)較HG組表達(dá)水平下降(P<0.01、)，同時(shí)間點(diǎn)MG組VEGF mRNA和蛋白于NG組無差別(P>0.05)； 3 ELISA結(jié)果：3h、6h、24h HG組Ⅳ型膠原(除外24hP<0.05)、LN、FN含量與NG組無顯著差別(P>0.05)，48h時(shí)HG組Ⅳ型膠原、LN、FN含量較NG組

13、增高(P<0.01，P<0.01，P<0.05)，且隨時(shí)間延長表達(dá)量有增高趨勢，藥物干預(yù)后上述指標(biāo)較HG組表達(dá)水平下降(P<0.01)；MG組較NG組無顯著差異(P>0.05)。 結(jié)論： 上述結(jié)果提示高糖環(huán)境GMC異常表達(dá)PDGF、VEGF及ECM可能參與了糖尿病腎損害的發(fā)生、發(fā)展過程；這些異常表達(dá)可能與腎臟細(xì)胞內(nèi)的一些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(如：MAPK等)激活有關(guān)。Valsartan、Fluvastatin可抑制高糖刺激下G