冬蟲夏草含藥血清對(duì)高糖培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細(xì)胞PEDF及VEGF表達(dá)的影響.pdf

1、目的：糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是糖尿病重要的慢性微血管并發(fā)癥之一。糖尿病腎病的早期病理改變?yōu)槟I小球基底膜的增厚和細(xì)胞外基質(zhì)的增多，由此導(dǎo)致了腎小球的超濾過和微量蛋白尿。有研究證實(shí)高糖能刺激系膜細(xì)胞合成大量的系膜基質(zhì)，導(dǎo)致腎小球硬化。研究表明，一些生長(zhǎng)因子，特別是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（transforming growth factor，TGF）-β1、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial

2、 growth factor，VEGF）和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF），與糖尿病腎臟病變的發(fā)病密切相關(guān)。高糖環(huán)境下，腎組織VEGF表達(dá)活性增加，一方面導(dǎo)致血管通透性增加，產(chǎn)生蛋白尿；另一方面，導(dǎo)致腎小球內(nèi)的單核巨噬細(xì)胞遷移活性增加，TGF-β1產(chǎn)生增加，細(xì)胞外基質(zhì)堆積，促進(jìn)腎小球硬化。而腎臟存在的色素上皮衍生因子（pigment epithlium-derived factor，PEDF

3、）可能通過內(nèi)源性抑制TGF-β1等途徑發(fā)揮了積極的腎臟保護(hù)作用。體外研究發(fā)現(xiàn)[1]，高糖環(huán)境可顯著減少PEDF在人腎小球系膜細(xì)胞中的分泌，提示高糖環(huán)境是導(dǎo)致PEDF分泌減少的一個(gè)直接原因，并且PEDF在糖尿病腎臟中表達(dá)的減少很可能促成了細(xì)胞外基質(zhì)的過度分泌和糖尿病腎病的發(fā)展。
　　 本試驗(yàn)運(yùn)用血清藥理學(xué)方法，對(duì)體外培養(yǎng)的高糖環(huán)境下大鼠腎小球系膜細(xì)胞應(yīng)用冬蟲夏草（Cordyceps sinensis，CS）含藥血清進(jìn)行干預(yù)，通過對(duì)

4、PEDF和VEGF的水平進(jìn)行測(cè)定，進(jìn)一步研究蟲草在糖尿病腎臟病變中的作用機(jī)制。
　　 方法：1、實(shí)驗(yàn)血清的制備：雄性SD大鼠35只，隨機(jī)分為3組，分別為正常對(duì)照組（n=18）、低劑量蟲草提取液喂養(yǎng)組[（5g/（kg·d），n=8）]及高劑量蟲草提取液喂養(yǎng)組[10g/（kg·d），n=9]。蟲草提取液每毫升含有相當(dāng)于0.98g的蟲草菌粉。以上各組，每日固定時(shí)間以灌胃給藥的方式進(jìn)行。正常對(duì)照組給予等量生理鹽水灌胃。給藥8天后，在最后

5、一次灌胃2h后，以玻璃毛細(xì)管（直徑1.0mm）經(jīng)大鼠眶后靜脈叢采血，6h內(nèi)離心、分離血清，并于56℃滅活30min，-80℃冰箱保存待用。2、細(xì)胞培養(yǎng)：將大鼠系膜細(xì)胞株（HBZY-1）接種于含10％FBS、100U/ml青霉素、100ug/ml鏈霉素的MEM培養(yǎng)基中，37℃、5％CO2飽和培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，每2-3天傳代一次，待細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后進(jìn)行操作。實(shí)驗(yàn)分組：①正常糖組（葡萄糖5.6mmol/L+正常對(duì)照組大鼠血清，NC組）；②

6、高糖組（葡萄糖30mmol/L+正常對(duì)照組大鼠血清，HG組）；③低藥組（葡萄糖30mmol/L+低劑量蟲草含藥血清，CS-LD組）；④高藥組（葡萄糖30mmol/L+高劑量蟲草含藥血清，CS-HD組）共四組。細(xì)胞傳代后，將HBZY-1細(xì)胞按每瓶2×105接種于25c㎡的培養(yǎng)瓶，貼壁24小時(shí)后用無血清MEM培養(yǎng)基靜止24小時(shí)，使細(xì)胞同步化進(jìn)入休止期，吸出培養(yǎng)基，換用四組不同MEM培養(yǎng)基作用24、72小時(shí)，分別收取細(xì)胞，流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)其細(xì)

7、胞周期變化，觀察CS對(duì)系膜細(xì)胞凋亡的影響；逆轉(zhuǎn)錄一多聚酶鏈反應(yīng)法（RT-PCR）測(cè)定細(xì)胞中PEDF及VEGF mRNA的表達(dá)；酶聯(lián)免疫分析法（ELISA）測(cè)定上清液中PEDF及VEGF蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果：1.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)提示，培養(yǎng)24、72h，HG組較NC組由G1期進(jìn)入S期的細(xì)胞數(shù)增加，G0～G1期細(xì)胞比例降低，S期細(xì)胞比例增高，細(xì)胞凋亡受到抑制（P（0.05）；在CS-LD組和CS-HD組中，G1期細(xì)胞數(shù)量增加，S期細(xì)

8、胞減少，系膜細(xì)胞凋亡率CS-HD組高于CS-LD組（P<0.05），兩組明顯高于HG組（P<0.05）。2.RT-PCR結(jié)果顯示，培養(yǎng)24、72h，HG組較NC組PEDFmRNA表達(dá)明顯下降（P<0.05），VEGFmRNA表達(dá)明顯上升（P<0.05）；CS-LD組和CS-HD組較HG組PEDFmRNA表達(dá)上調(diào)（P<0.05），VEGFmRNA表達(dá)下降（P<0.05）。3.ELISA結(jié)果顯示，①培養(yǎng)24h四組細(xì)胞上清液中PDEF含量無明

9、顯差別（P>0.05）；72hHG組上清液中PDEF含量明顯低于NC組（P（0.05），CS-LD組和CS-HD組上清液中PEDF表達(dá)上調(diào)，高于HG組（P<0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，CS-LD組和CS-HD組PDEF含量無明顯差別（P>0.05）。②培養(yǎng)24h及72h HG組系膜細(xì)胞上清液中VEGF含量明顯高于NC組（P<0.05），CS-LD組和CS-HD組上清液中VEGF含量顯著低于HG組（P<0.05），兩組之間無明顯差別（

10、P>0.05）。
　　 結(jié)論：1、冬蟲夏草可抑制高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞數(shù)量增加，促進(jìn)系膜細(xì)胞凋亡，并有一定的濃度依賴性。2、高糖環(huán)境下系膜細(xì)胞PEDFmRNA表達(dá)下降，VEGFmRNA表達(dá)上調(diào)，可能是糖尿病腎病系膜細(xì)胞增殖，腎小球硬化的機(jī)制之一。冬蟲夏草可上調(diào)系膜細(xì)胞PEDF表達(dá)，下調(diào)VEGF表達(dá)，提示冬蟲夏草可在mRNA水平上影響PEDF及VEGF的表達(dá)，對(duì)高糖所致的腎小球系膜細(xì)胞增殖起到一定的抑制作用。3、高糖環(huán)境可抑制系膜細(xì)胞