STAT1在高糖作用體外培養(yǎng)人腎小球系膜細(xì)胞自噬和衰老中的作用機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　在我國，老齡化問題已日趨嚴(yán)重，甚至已成為全球性重大問題之一。腎臟是受衰老影響最明顯的器官之一。隨著年齡的增加，慢性腎臟病(CKD)的發(fā)病率逐年上升，說明衰老是進(jìn)展性腎臟病的重要因素。因此，尋找有效延緩腎臟衰老的方法尤為重要，也是國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的重要問題之一。
　　人腎小球系膜細(xì)胞(HGMC)是腎臟主要的固有細(xì)胞，也是腎小球中功能最活躍的細(xì)胞。器官衰老與細(xì)胞衰老之間有著密不可分的聯(lián)系。目前HGMC已經(jīng)被應(yīng)用為研究腎

2、臟衰老機(jī)制切入點(diǎn)。而衰老的機(jī)制非常復(fù)雜，至今并未完全闡明。自噬是最近鑒別出的新的衰老相關(guān)機(jī)制之一。多項(xiàng)研究表明增強(qiáng)自噬可以延緩衰老。因此積極尋找調(diào)控自噬的通路對(duì)腎臟衰老機(jī)制的研究至關(guān)重要。
　　STAT1是信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化子蛋白(STAT)家族中第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的蛋白。有研究表明STAT1在調(diào)控心肌細(xì)胞凋亡的同時(shí)也負(fù)向調(diào)控自噬。我們前期研究發(fā)現(xiàn)STAT1參與了高糖體外培養(yǎng)HGMC的衰老過程，但其在HGMC衰老中的作用機(jī)制尚不十分清楚

3、。本研究通過高糖（含糖30mmol/L）刺激HGMC誘導(dǎo)衰老模型，觀察HGMC衰老過程中自噬與STAT1是否有一定關(guān)聯(lián)及自噬與衰老的關(guān)系，并通過藥物特異性抑制及基因沉默STAT1對(duì)HGMC自噬和衰老的影響，以進(jìn)一步探討研究腎臟衰老機(jī)制從而延緩腎臟衰老提供新的理論依據(jù)。
　　材料和方法：
　　1、HGMC衰老的誘導(dǎo)、HGMC衰老過程中STAT1、PSTAT1及自噬活性的變化和自噬對(duì)P53/P21信號(hào)通路的影響
　　采用高

4、糖作為誘導(dǎo)HGMC衰老的刺激因素，建立HGMC衰老模型，細(xì)胞同步化后分為：正常糖對(duì)照組（含糖5.5mmol/L）;高滲對(duì)照組（含糖5.5mmol/L+甘露醇24.5mmol/L）;高糖組（含糖30.0mmol/L）作用不同時(shí)間點(diǎn)組：12h、24h、48h、72h;高糖加自噬增強(qiáng)劑雷帕霉素（RAPA）干預(yù)組（含糖30.0mmol/L+RAPA500nmol/L，培養(yǎng)72h，其中RAPA提前一小時(shí)刺激）;高糖加自噬抑制劑3MA干預(yù)組（含糖3

5、0.0mmol/L+3MA2mmol/L，培養(yǎng)72小時(shí)，其中3MA提前一小時(shí)刺激）。通過細(xì)胞形態(tài)、β-半乳糖苷酶染色陽性率、Western blot法檢測衰老相關(guān)蛋白P53、P21表達(dá)變化證實(shí)HGMC衰老并檢測STAT1、PSTAT1、自噬相關(guān)指標(biāo)LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、P62的變化以及電鏡觀察自噬小體數(shù)量，另外通過應(yīng)用RAPA和3MA干擾自噬活性后，檢測高糖誘導(dǎo)HGMC衰老過程中P53及P21的表達(dá)變化。
　　2、干擾STAT1后，

6、HGMC自噬活性和衰老的變化
　　分別以STAT1—siRNA轉(zhuǎn)染HGMC對(duì)STAT1基因沉默以及應(yīng)用不同濃度氟達(dá)拉濱對(duì)STAT1特異性藥物抑制，用上述濃度的高糖刺激相應(yīng)時(shí)間，同樣設(shè)立高滲對(duì)照組同上，應(yīng)用光鏡觀察細(xì)胞形態(tài)、Western blot檢測STAT1、PSTAT1和自噬標(biāo)記蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、P62表達(dá)變化、透射電鏡觀察自噬體的形成，另外觀察β-半乳糖苷酶染色陽性率。
　　結(jié)果：
　　1、HGMC衰老表型

7、特征以及HGMC衰老過程中STAT1、PSTAT1、自噬活性的變化和自噬對(duì)P53/P21信號(hào)通路的影響
　　光鏡下觀察：正常糖組細(xì)胞呈條梭形生長、排列規(guī)則、細(xì)胞邊界清晰，多呈單核表現(xiàn);高滲對(duì)照組細(xì)胞隨著培養(yǎng)時(shí)間延長，體積逐漸增大，細(xì)胞出現(xiàn)水腫，其中偶見顆?；蚩张?，排列不規(guī)則;與正常糖組比較，高糖組細(xì)胞隨著培養(yǎng)時(shí)間延長，多形核及雙核細(xì)胞逐漸增多，細(xì)胞體積變大，胞漿區(qū)域扁平，其中常見顆?；蚩张?，排列不規(guī)則。β-半乳糖苷酶染色陽性率：與

8、正常糖組11.37±2.92％比較，高糖組細(xì)胞88.35±2.33％明顯升高，差異有顯著性(P＜0.05)，而高滲對(duì)照組14.35±4.80％無顯著增加。電鏡下自噬體數(shù)量觀察：與正常糖組每個(gè)細(xì)胞內(nèi)自噬體數(shù)量11.50±2.26比較，高糖刺激48小時(shí)組5.67±2.33和高糖刺激72小時(shí)組6.00±2.28顯著降低(P＜0.05)，而高滲對(duì)照組11.50±2.17無顯著差異。Western blot結(jié)果：與正常糖組比較，高糖作用48和72

9、小時(shí)組STAT1、PSTAT1、P62、P53、P21表達(dá)均顯著增加(P＜0.05)，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達(dá)顯著下降(P＜0.05)，而高滲對(duì)照組無顯著性差異。應(yīng)用自噬增強(qiáng)劑和抑制劑刺激干預(yù)72小時(shí)后，β-半乳糖苷酶染色陽性率：與正常糖組19.74±2.54％比較，高糖組88.78±1.82％顯著升高，(P＜0.05)，高滲對(duì)照組20.21％±1.20無顯著性差異;與高糖組比較，高糖加RAPA組43.04±4.71％顯著下降(P＜0.0

10、5)，高糖加3MA組83.49±3.13％無顯著差異。Western blot結(jié)果：與正常糖組比較，高糖組P62、P53、P21表達(dá)顯著增加(P＜0.05)，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達(dá)顯著下降(P＜0.05)，高滲對(duì)照組無顯著差異;與高糖組比較，高糖加RAPA組P62、P53、P21表達(dá)顯著下降(P＜0.05)，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達(dá)顯著升高(P＜0.05)，高糖加3MA組無顯著性差異。
　　2、干擾STAT1后，HGMC自噬活性和衰

11、老表型特征的變化
　　光鏡下觀察：正常糖組細(xì)胞呈條梭形生長、排列規(guī)則、細(xì)胞邊界清晰，多呈單核表現(xiàn);高滲對(duì)照組細(xì)胞隨著培養(yǎng)時(shí)間延長，體積逐漸增大，細(xì)胞出現(xiàn)水腫，其中偶見顆?；蚩张?，排列不規(guī)則;與正常糖組比較，高糖組細(xì)胞多形核及雙核細(xì)胞逐漸增多，細(xì)胞體積變大，胞漿區(qū)域扁平，其中常見顆粒或空泡，排列不規(guī)則;與高糖組比較，高糖加氟達(dá)拉濱干預(yù)組細(xì)胞隨著氟達(dá)拉濱濃度增高，細(xì)胞形態(tài)逐漸趨于條梭形生長、排列規(guī)則、細(xì)胞邊界清晰，但氟達(dá)拉濱最高濃度1

12、00umol/L組細(xì)胞數(shù)量明顯見少，視野下觀察細(xì)胞數(shù)量小于50％。Western blot結(jié)果：與正常糖組比較，高糖組STAT1、PSTAT1、P62表達(dá)明顯增加，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達(dá)明顯下降，高滲對(duì)照組無明顯差異;與高糖組比較，高糖加氟達(dá)拉濱(50umol/L)干預(yù)組及高糖加STAT1-siRNA組STAT1、PSTAT1、P62表達(dá)明顯降低，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達(dá)明顯增加。電鏡下自噬體數(shù)量觀察：與正常糖組每個(gè)細(xì)胞內(nèi)自噬體數(shù)量11.

13、50±2.26比較，高糖組6.00±2.28顯著降低(P＜0.05），而高滲對(duì)照組11.50±2.17無顯著性差異;與高糖組比較，高糖加氟達(dá)拉濱(50umol/L)組19.16±7.08和高糖加STAT1-siRNA組23.66±7.66顯著性升高(P＜0.05)。β-半乳糖苷酶染色陽性率：與正常糖組21.18±2.31％比較，高糖組85.53±1.85％顯著性升高(P＜0.05)，高滲對(duì)照組21.84±2.30無顯著性差異;與高糖組比

14、較，高糖加氟達(dá)拉濱(50umol/L)組49.67±5.36％和高糖加STAT1-siRNA組48.50±3.63％顯著性下降（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1、高糖30mmol/L于體外刺激HGMC72小時(shí)可以誘導(dǎo)其衰老，且其促衰老作用與高滲透壓無關(guān);高糖可激活HGMC STAT1通路，隨著延長高糖作用HGMC刺激時(shí)間，自噬活性受到抑制，并出現(xiàn)衰老表達(dá);高糖可激活P53/P21通路，通過增強(qiáng)自噬活性，可以抑制P53/P