TRB3在非諾貝特抑制高糖誘導(dǎo)下腎小球系膜細胞增殖中的作用及其機制研究.pdf

1、研究背景:
　　 糖尿病是一種嚴重危害人類健康的全球性疾病，其患病率逐年攀升。我國已成為僅次印度的第二大糖尿病國家。隨著其病情的演變，將逐漸引起眼、腎、神經(jīng)、心臟、血管等組織的慢性進行性改變。糖尿病腎病(diabeticnephropathy，DN)是最常見的糖尿病微血管病變之一，其早期表現(xiàn)為微量尿蛋白，隨著病情進展，將逐步衍變?yōu)閺浡曰蚪Y(jié)節(jié)性腎小球硬化，最終導(dǎo)致終末期腎功能衰竭。在西方發(fā)達國家，每年大約40％的糖尿病患者發(fā)展為

2、DN。DN主要是由腎小球系膜細胞的過度增殖及其分泌的系膜基質(zhì)蛋白、膠原纖維蛋白在系膜區(qū)堆積等一系列改變逐步演變而來。
　　 磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidy linositol3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinases B，Akt)信號通路廣泛存在于各種細胞，各種酪氨酸生長因子可與其相應(yīng)的配體結(jié)合通過一系列反應(yīng)激活PI3K，PI3K與AKT結(jié)合使AKT磷酸化進而激活A(yù)KT，磷酸化的AKT通

3、過調(diào)控其下游周期蛋白的表達發(fā)揮調(diào)控細胞周期的作用。既往研究證實，高糖可以通過PI3K/AKT通路誘導(dǎo)腎小球系膜細胞(glomerular mesangial cell，MC)過度增殖。因此，抑制PI3K/AKT通路可以抑制MC增殖，從而可以緩解DN的發(fā)生、發(fā)展。然而，近年來的很多研究發(fā)現(xiàn)PI3K抑制劑的特異性不高，且毒副作用大，缺乏很好的臨床實用性。因此，抑制AKT成為抑制PI3K/AKT通路的新方向。
　　 Tribbles同

4、源蛋白3(tribbles homolog3，TRB3)是調(diào)節(jié)細胞有絲分裂的假性激酶蛋白。近年來研究發(fā)現(xiàn)TRB3可以通過抑制AKT的磷酸化抑制PI3K/AKT信號通路，從而發(fā)揮調(diào)控細胞周期、促進細胞凋亡的作用。這一通路在胰腺、肝臟、淋巴細胞、結(jié)腸癌等研究中均得到驗證。而且，生理條件下TRB3在腎臟中有少量表達。因此，我們推測:促進TRB3的表達可能抑制PI3K/AKT通路進而抑制腎小球系膜細胞的增殖。
　　 近來的研究表明過氧化

5、物酶增殖體激活受體(peroxisome proliferatoractivated receptor alpha，PPAR-α)可與TRB3基因啟動子的-750至-350之間的序列結(jié)合，PPAR-α激動劑可以促進TRB3的表達抑制AKT的磷酸化，進而發(fā)揮促凋亡的作用。非諾貝特是人工合成的PPAR-α激動劑，在淋巴細胞、胰腺癌等的研究中已證實，非諾貝特可以通過以上機制促使細胞發(fā)生周期阻滯，促進細胞凋亡。大量研究證實，PPAR-α在腎小球

6、系膜細胞中有少量表達。因此，我們推測:非諾貝特可以通過促進TRB3表達抑制AKT磷酸化，進而抑制腎小球系膜的增殖。
　　 腎小球系膜細胞增殖是在細胞周期蛋白的調(diào)控下嚴密進行的，其細胞周期按照各時相（G1-S-G2-M）嚴格有序進行。細胞能否進入M期以及能否順利完成有絲分裂進行增殖，主要取決于能否順利通過G1/S轉(zhuǎn)換和G2/M轉(zhuǎn)換。而細胞周期主要是通過磷酸化的AKT調(diào)控其下游周期蛋白的表達實現(xiàn)。然而，目前尚不明確非諾貝特能否通過促

7、進TRB3的表達抑制AKT的磷酸化，進而下調(diào)其下游周期蛋白的表達，并使腎小球系膜細胞發(fā)生周期阻滯，最終抑制腎小球系膜細胞的增殖。因此，我們以腎小球系膜細胞為研究對象，探討腎小球系膜細胞中TRB3的表達，明確非諾貝特能否通過促進TRB3的表達調(diào)控細胞周期進而抑制腎小球細胞的增殖，以期為非諾貝特防治DN的發(fā)生發(fā)展提供理論及臨床依據(jù)。
　　 研究目的:
　　 本課題擬在建立高糖誘導(dǎo)腎小球系膜細胞增殖為研究模型的基礎(chǔ)上，通過觀察

8、非諾貝特對腎小球系膜細胞TRB3蛋白表達影響，并檢測其對磷酸化的AKT的表達影響，探討非諾貝特對高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細胞增殖的影響及機制。
　　 研究方法:
　　 1.非諾貝特藥物的配置
　　 取360.84mg非諾貝特溶于10mlDMSO中配成100mmol/L母液。按照高糖DMEM:非諾貝特母液=9∶1稀釋非諾貝特，即可得100μmol/L非諾貝特，按1∶1、1∶9的比例稀釋100μmol/L非諾貝特即可得5

9、0、10μmol/L非諾貝特。
　　 2.腎小球系膜細胞的培養(yǎng)及分組
　　 取處于對數(shù)生長期的腎小球系膜細胞，按適當比列接種于6、24、96孔板，靜置6小時貼壁后，換成含1％胎牛血清的低糖DMEM使其同步化處于C0期，將系膜細胞分為正常對照組（N，5.5mmol/L葡萄糖）、高糖組（H，25mmom/L葡萄糖）、高糖+不同濃度的非諾貝特（10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L的非諾貝特）。
　　

10、3.CCK-8法測定細胞的活力:
　　 腎小球系膜細胞以1×104/ml接種至96孔板中，按上述分組處理后，培養(yǎng)24h，PBS洗一次每孔加入100μL的DMEM和10μL CCK8試劑混勻，并設(shè)置無細胞但含有DMEM和CCK8的空白對照組。于450nm波長測吸光度以判斷細胞活力。
　　 4.Hoechst33258染色和吖啶橙染色觀察各組腎小球系膜細胞凋亡形態(tài)學(xué)改變:
　　 腎小球系膜細胞以1×105/ml接種至

11、6孔板中，按上述分組處理，培養(yǎng)24小時后，PBS洗2次，用4％多聚甲醛固定，加入Hoechst33258、吖啶橙染色在熒光顯微鏡下觀察非諾貝特對腎小球系膜細胞凋亡的影響
　　 5.流式細胞術(shù)檢測非諾貝特作用后腎小球細胞的周期改變:
　　 腎小球系膜細胞以1×106/ml接種至6孔板中，按上述分組處理，培養(yǎng)24小時后，胰酶消化各組細胞，并收集細胞懸液離心，棄上清液，加入PBS液，調(diào)節(jié)細胞濃度至1×106/ml。重復(fù)沈兩次后

12、，加入70％乙醇固定過夜。離心，PBS沈兩次后，加入RNA酶于37℃水浴30分鐘，再加入碘化丙啶于4℃染色30分鐘，上流式機檢測樣本，Cell Quest軟件分析細胞周期變化。
　　 6.免疫細胞化學(xué)觀察各組TRB3蛋白的表達及變化:
　　 腎小球系膜細胞以2×104/ml接種于放有蓋玻片的24孔板內(nèi)，按上述分組處理，培養(yǎng)24小時后，撈出蓋玻片。多聚甲醛脫水固定30 min， PBS洗3次;用3％H2O2-甲醇封閉內(nèi)源性

13、過氧化物酶10min，PBS洗3次;0.3％Triton的PBS孵育10min，PBS洗3次;非免疫兔血清濕盒內(nèi)封閉30min;吸棄多余血清，加TRB3抗體，4℃過夜;滴加二抗100μL，37℃孵育30 min，PBS洗滌3次，ABC法染色，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，滴加封片劑封片。并在免疫熒光鏡下觀察TRB3表達情況。
　　 7.Western Blot技術(shù)檢測非諾貝特對腎小球系膜細胞中TRB3、p-AKT表達影響

14、:
　　 按上述分組處理細胞。收集總蛋白，BCA法測蛋白濃度，12％ SDS-PAGE膠上電泳，100V、1h半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)至PVDF上，5％脫脂牛奶封閉1h。洗膜后，加入TRB3多克隆抗體（1∶500稀釋）或者P-AKT單克隆抗體（1∶500稀釋）4℃過夜。洗膜后，二抗（1∶2000稀釋）孵育1h。加入化學(xué)發(fā)光劑ECL，暗室曝光，顯影、定影后掃描，用ImageJ圖像分析系統(tǒng)分析結(jié)果。蛋白的相對表達量為目的蛋白的灰度值與以GAPD

15、H為內(nèi)參進行半定量分析。以上實驗重復(fù)3次。
　　 8.統(tǒng)計方法
　　 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示，多組樣本均數(shù)，先進行方差齊性分析，再采用OneWay-ANOVA進行方差分析，方差齊時兩兩比較采用LSD檢驗，方差不齊時用Welch校正后使用Dunnett's T3檢驗，P＜0.05表示差別具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 研究結(jié)果:
　　 1.不同濃度非諾貝特對腎小球系膜細

16、胞增殖活力影響:
　　 高糖環(huán)境下培養(yǎng)24小時，腎小球系膜細胞OD值為(0.80±0.06)，顯著常高于正常對照組(0.58±0.05)（P=0.000），10、50、100μmol/L非諾貝特各組的OD值分別為(0.67±0.02)、(0.56±0.02)、(0.44±0.03)顯著低于高糖組（P=0.000），各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=71.584，P=0.000）
　　 2.Hoechst33258染色和吖啶橙染

17、色后熒光顯微鏡下觀察:
　　 正常對照組腎小球系膜細胞染色的細胞核呈均勻淡藍光或綠光，高糖組與正常對照組相比未見明顯差異，非諾貝特組的細胞皺縮，細胞核致密濃染、染色質(zhì)邊集、可見核碎裂.
　　 3.流式細胞術(shù)檢測細胞周期示:
　　 高糖組腎小球系膜細胞G0/G1期比例為(71.81±0.92)％，顯著低于正常對照組(85.72±0.35)％(P=0.000)，10、50、100μmol/L非諾貝特各組G0/G1期比

18、例分別為(78.78±4.12)％、(82.04±0.43)％、(84.71±0.21)％，顯著高于高糖組(P均=0.000)，各組間G0/G1期細胞比例差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=115.775，P=0.000）。
　　 4.免疫細胞化學(xué)熒光鏡下觀察:
　　 正常對照組、高糖組、非諾貝特組腎小球系膜細胞均有TRB3蛋白表達，其表達部位主要定位于細胞漿，正常對照組、高糖組胞漿染色呈淺黃-棕色，表達呈弱陽性。非諾貝特組呈棕色，表

19、達呈強陽性，且隨著非諾貝特濃度增加TRB3表達增強。
　　 5.Western-Blot技術(shù)顯示
　　 高糖組TRB3蛋白相對灰度值為(0.34±0.03)，與正常對照組(0.37±0.01)相比無明顯差異(P=0.568)，10、50、100μmol/L非諾貝特各組相對灰度值分別為(0.52±0.04)、(0.58±0.01)、(0.62±0.03)，顯著高于高糖組(P均=0.000)。高糖組p-AKT蛋白相對灰度值為

20、(1.84±0.02)，與正常對照組(1.39±0.04)相比表達量明顯增多（P=0.000），10μmol幾非諾貝特p-AKT蛋白相對灰度值分別為(1.83±0.03)，與高糖組相比無差異（P=0.079），50、100μmol/L非諾貝特p-AKT蛋白相對灰度值分別(1.58±0.03)、(1.45±0.04)顯著低于高糖組(P均=0.000)
　　 研究結(jié)論:
　　 非諾貝特可以抑制高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細胞增殖，使