還原型β2糖蛋白I抑制高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞VEGF-NO軸解偶聯(lián)的機制.pdf

1、目的：
　　糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是糖尿病最常見和最嚴(yán)重的慢性并發(fā)癥之一，亦是導(dǎo)致終末期腎功能衰竭的重要原因。我國DN的患病率呈快速增長的趨勢，DN已成為糖尿病患者致死的主要原因之一。DN的發(fā)病機制復(fù)雜，近來研究發(fā)現(xiàn)VEGF-NO軸解耦聯(lián)是DN的致病機制之一。我們前期研究證實還原型β2糖蛋白I（reducedβ2-Glycoprotein I，r-β2GPI）可調(diào)節(jié)VEGF信號通路，抑制糖尿病

2、視網(wǎng)膜病變新生血管形成，此外r-β2GPI可抑制TGF-β1-p38 MAPK信號途徑減輕糖尿病小鼠腎病的程度及抑制高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞IV型膠原的表達(dá)。本研究以大鼠腎小球系膜細(xì)胞系HBZY-1為研究對象，旨在探討：1.β2GPI及r-β2GPI對高糖條件下HBZY-1細(xì)胞VEGF-NO軸功能的影響；2.β2GPI及r-β2GPI影響高糖條件下HBZY-1細(xì)胞VEGF-NO軸功能的機制。
　　方法：
　　1.培養(yǎng)HBZY

3、-1細(xì)胞。實驗共分為6組：①正常對照組（NC組）：5.5mM葡萄糖；②高滲對照組（MC組）：5.5mM葡萄糖+19.5mM甘露醇；③高糖組（HG組）：25mM葡萄糖；④高糖+ HSA對照組（HSA組）：25mM葡萄糖+100μg/ml HSA；⑤高糖+β2GPI干預(yù)組（β2GPI組）：25mM葡萄糖+100μg/mlβ2GPI；⑥高糖+ r-β2GPI干預(yù)組（r-β2GPI組）：25mM葡萄糖+100μg/ml r-β2GPI。

4、　　2. NO測試盒測定β2GPI和r-β2GPI對高糖條件下HBZY-1細(xì)胞分泌NO的影響；采用 ROS熒光探針 DCFH-DA，通過熒光顯微鏡定性觀察及流式細(xì)胞儀定量檢測β2GPI和r-β2GPI對高糖條件下HBZY-1細(xì)胞生成ROS的影響。
　　3. qRT-PCR法檢測β2GPI和r-β2GPI對高糖條件下HBZY-1細(xì)胞VEGF-NO軸相關(guān)蛋白VEGF、VEGFR-2、eNOS、GCH-1 mRNA表達(dá)的影響。
　

5、　4. Western Blot法觀察β2GPI和r-β2GPI對高糖條件下HBZY-1細(xì)胞VEGF-NO軸關(guān)鍵蛋白eNOS活性的影響及對VEGF受體后信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中Akt磷酸化水平的影響。
　　結(jié)果：
　　1.高糖可明顯抑制HBZY-1細(xì)胞NO的生成達(dá)33％（P＜0.05），β2GPI及r-β2GPI可拮抗高糖引起的NO表達(dá)減少，促進(jìn)NO的生成（P＜0.05），且r-β2GPI天津醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文
　　的作用強于

6、β2GPI，分別是HG組的2.10倍、1.88倍（P＜0.05）。
　　2.與正常對照組相比，高滲及高糖均促進(jìn)HBZY-1細(xì)胞ROS的生成（P＜0.05），高糖條件下HG組及HSA組兩組間ROS平均熒光強度無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），均明顯高于NC組和MC組（P＜0.05），β2GPI及r-β2GPI可抑制高糖條件下HBZY-1細(xì)胞ROS的生成，降低ROS水平（P＜0.05），且r-β2GPI的作用強于β2GPI（P＜0.05）

7、。
　　3.高糖可促進(jìn)HBZY-1細(xì)胞VEGF、VEGFR-2 mRNA的表達(dá)（P＜0.05），抑制GCH-1 mRNA的表達(dá)（P＜0.05），但對eNOS mRNA的表達(dá)無明顯影響（P＞0.05）。β2GPI及r-β2GPI對高糖條件下HBZY-1細(xì)胞VEGF的表達(dá)無明顯影響（P＞0.05），可降低高糖條件下VEGFR-2 mRNA的表達(dá)水平（P＜0.05），增加高糖條件下GCH-1、eNOS mRNA的表達(dá)。β2GPI組和r-

8、β2GPI組兩組間VEGF、VEGFR-2、GCH-1、eNOS mRNA的表達(dá)水平均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。
　　4.高糖抑制HBZY-1細(xì)胞eNOS Ser1177的磷酸化（P＜0.05），β2GPI及r-β2GPI可提高高糖條件下eNOS Ser1177的磷酸化水平（P＜0.05），兩者之間無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。
　　5.高糖抑制HBZY-1細(xì)胞Akt的磷酸化（P＜0.05），β2GPI及r-β2GPI可

9、促進(jìn)高糖條件下Akt的磷酸化（P＜0.05），兩者之間的作用無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。結(jié)論：
　　1.高糖環(huán)境下HBZY-1細(xì)胞VEGF、VEGFR-2 mRNA水平升高，GCH-1 mRNA表達(dá)減少，eNOS mRNA表達(dá)無明顯改變，但eNOS磷酸化水平明顯降低，致NO分泌減少且ROS生成增加，即存在高糖誘導(dǎo)下的系膜細(xì)胞VEGF-NO軸解偶聯(lián)。
　　2.β2GPI及r-β2GPI均可拮抗高糖環(huán)境下HBZY-1細(xì)胞NO分

10、泌減少和ROS生成增多，促進(jìn)GCH-1 mRNA的表達(dá)，降低VEGFR-2 mRNA的表達(dá)水平，促進(jìn)Akt磷酸化，提高eNOS的磷酸化水平?？赡軝C制為β2GPI及r-β2GPI通過調(diào)節(jié)VEGFR-2的表達(dá)及VEGF受體后信號通路中的關(guān)鍵蛋白Akt的磷酸化水平，激活eNOS，增加NO分泌，減輕氧化應(yīng)激水平，對高糖環(huán)境下的系膜細(xì)胞起保護(hù)作用。
　　3.與β2GPI相比，r-β2GPI促進(jìn)HBZY-1細(xì)胞NO分泌、抑制ROS生成的作用更