STAT1 siRNA轉(zhuǎn)染對高糖培養(yǎng)人腎小球系膜細(xì)胞STAT3及轉(zhuǎn)化生長因子-β1表達(dá)的影響.pdf

1、糖尿病(DM)是一組是由于胰島素分泌和/或胰島素作用缺陷所引起的，以慢性血葡萄糖（簡稱血糖）水平增高為特征的代謝性疾病。隨著人們生活水平的提高和人口的老齡化，糖尿病的發(fā)病率逐年上升，糖尿病患者總數(shù)也在全球范圍內(nèi)逐年增多。目前全球約有糖尿病病人1.7億人，這個(gè)數(shù)到2030年可能增加一倍[1]。人口老齡化和居民生活方式的改變使得我國的糖尿病患病率呈現(xiàn)明顯的上升趨勢。據(jù)國家衛(wèi)生部調(diào)查顯示，我國每天約新增3000例，每年約增加120萬糖尿病患者

2、，其中約95.00％為2型糖尿病患者[2]。長期高血糖可導(dǎo)致多種組織，器官的損傷，功能障礙和衰竭，自從20世紀(jì)90年代以后由糖尿病導(dǎo)致的終末期腎病(ESRD)發(fā)生率增加了一倍，而且還在往上升[3]。
　　 目前認(rèn)為糖尿病腎病的發(fā)病過程中有多種酶和轉(zhuǎn)錄因子被激活，涉及多條細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(DAG/PKC、MAPK、JAK/STAT)殺傷靶器官。大量研究表明，JAK/STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與系膜細(xì)胞的增殖，肥大及細(xì)胞外基質(zhì)分泌有關(guān)。

3、而腎小球系膜細(xì)胞作為腎臟最重要的固有細(xì)胞，其表型和功能的改變在糖尿病腎病的進(jìn)程中必然發(fā)揮著重要的作用。因此探索RNAi沉默STAT1基因后高糖刺激下系膜細(xì)胞JAK2/STAT3通路表達(dá)變化對于揭示糖尿病腎病的機(jī)制有重要的指導(dǎo)意義。
　　 STAT1是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的STAT蛋白，在干擾素信號中發(fā)揮重要作用，主要使細(xì)胞生長停滯，促進(jìn)凋亡。在我們先前的研究中已經(jīng)證實(shí)，高糖刺激下腎小球系膜細(xì)胞中STAT1與STAT3蛋白表達(dá)均有變化。研

4、究表明STAT1與STAT3在系膜細(xì)胞增殖中扮演不同的角色，STAT1激活對系膜細(xì)胞增殖有抑制作用，而STAT3激活對系膜細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用。STAT1的活化可以抑制細(xì)胞生長，參與細(xì)胞周期調(diào)控，但是STAT1的抑制增殖作用在JAK/STAT通路中可被其他STAT亞型(如STAT3)活化所掩蓋。如何促進(jìn)STAT1的有益作用，并避免被其他STAT亞型的負(fù)面作用所掩蓋，是我們治療糖尿病腎病的新思路[4-7]。
　　 為此我們設(shè)計(jì)了以下

5、實(shí)驗(yàn):
　　 目的：
　　 1.觀察RNAi沉默STAT1基因后高糖培養(yǎng)人腎小球系膜細(xì)胞的增殖情況及細(xì)胞內(nèi)STAT1、p-STAT1、STAT3、p-STAT3蛋白的表達(dá)變化，探討糖尿病狀態(tài)下STAT1和STAT3活性變化。
　　 2.觀察RNAi沉默STAT1基因后高糖培養(yǎng)人腎小球系膜細(xì)胞JAK/STAT通路下游TGF-β1的表達(dá)變化，探討STAT亞型變化對JAK/STAT通路下游TGF-β1的影響，從而為糖尿

6、病腎病提供新的治療靶點(diǎn)。
　　 方法：
　　 設(shè)計(jì)并合成針對STAT1基因的三個(gè)特異性siRNA序列，應(yīng)用lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑將STAT1-siRNA轉(zhuǎn)染入HMCs。激光共聚焦顯微鏡鑒定轉(zhuǎn)染效率，應(yīng)用Western blot、Real-timePCR方法篩選最有效抑制STAT1表達(dá)的干擾序列用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染有效干擾序列24 h后，用25mmol/1高糖濃度刺激相應(yīng)時(shí)間，MTT檢測各組系膜細(xì)胞的增殖

7、情況并用Westem blot法檢測各組細(xì)胞STAT1、p-STAT1、STAT3、p-STAT3蛋白的表達(dá)變化，ELISA檢測TGF-β1的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果：
　　 HMCs轉(zhuǎn)染后48 h及72 h收集細(xì)胞，分別用Real-time PCR和Western blot方法檢測干擾效率，STAT1 mRNA水平降低約56.7％，蛋白水平也明顯降低，證實(shí)干擾成功，同時(shí)用陰性對照證實(shí)干擾的特異性。
　　 1.正常

8、糖濃度組與高糖濃度組MTT490nm處OD值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而STAT1-siRNA+高糖濃度組與高糖組490nm處OD值差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;而正常糖濃度組與甘露醇組490hm處OD值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　 2.P-STAT1，P-STAT3在高糖濃度組的表達(dá)較正常糖濃度組明顯升高，甘露醇組與正常糖濃度組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且各組之間STAT1，STAT3表達(dá)也無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

9、而與高糖濃度組相比，STAT1-siRNA+高糖濃度組STAT1，P-STAT1的表達(dá)降低，STAT3，P-STAT3的表達(dá)卻進(jìn)一步升高（P＜0.05）。
　　 3.JAK/STAT通路的下游因子TGF-β1在高糖濃度組的表達(dá)較正常糖濃度組明顯升高并且呈時(shí)間依賴性，甘露醇組與正常糖濃度組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而且STAT1-siRNA+高糖濃度組較高糖濃度組TGF-β1表達(dá)更高（P＜0.05）。
　　 結(jié)論：